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荧光定量pcr引物
荧光定量PCR
(二) —
引物
与探针
答:
如果溶解
引物
的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻融,并使用10 mM Tris pH 7.5缓冲液溶解引物。
实时
荧光定量PCR
中两种
引物
的设计有什么要求
答:
1、
引物
长度一般为15-30bp,常用的为18-27bp 2、引物GC含量一般为40%-60%,以45-55%为宜,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右,至少要在55-80℃之间,Tm值曲线以选取72度附近为佳,5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合;4、ΔG值(...
普通pcr引物设计和
荧光定量pcr引物
设计的区别
答:
1、普通pcr引物设计:引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。2、
荧光定量pcr引物
设计:通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,标记跟踪PCR产物进行实时监测反应,利用与之相适应的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度 二、原理不同 1、普通pcr引物设计:为了找到一对合适的核苷酸片段,使其...
荧光定量PCR
的
引物
怎么设计
答:
1、查找该物种或近缘物种信息,看是否能确定内含子序列的位置,在CDS上设计跨内含子的
引物
,以避免基因组污染;2、扩增片段大小最好在200bp左右,太大会影响扩增效率;3、最好一次分别设计两条上游(距离较近)和下游引物(距离较近),组合成4个扩增片段;4、用任何方法或软件设计好的引用都要用少量...
如何设计
荧光定量PCR
的
引物
及TaqMan探针
答:
e)怎么优化探针和
引物
的浓度 对于双探针反应,通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果,,能获得最低的CT值,以及相对于背景来说
荧光
值有最高的增长。引物浓度应该在50nM -900nM 范围内进行优化,下面的表格显示了前后引物9种可能浓度组合的结果 探针浓度应该在50-250nM范围内优化 前引物 后引物 50...
荧光定量PCR引物
为什么要跨内含子设计
答:
引物
若跨内含子的话,引物仅能以3'端的一小部分结合基因组DNA,这样的话Tm会很低。在较高的退火温度下,引物几乎无法和基因组DNA结合来引发聚合,而主要是与能够完全配对的cDNA结合并引发反应。
荧光定量PCR
的
引物
能直接跑普通PCR吗?
答:
可以的 不过扩增出来的片段也就一两百bp,要用2%的琼脂糖胶跑电泳检测
实时
荧光定量PCR
中两种
引物
的设计有什么要求
答:
参照以下real-time
PCR引物
设计原则:1.最好位于编码区5’端的300-400bp区域内,可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%~60%之间,45-55%最佳。5.碱基要随机分布,...
如何设计sybrgreen法
荧光定量pcr引物
答:
引物
荧光定量PCR
是利用荧光定量PCR 仪(如ABI 7500、stepone、ROChe LightCycler、Bio-Rad CFX96 等)通过实时追踪 PCR 每一步循环的荧光信号 值来达到对起始模板量的定量分析。一次成功的
荧光定量 PCR
反应除了需要稳 定的仪器、优质的 Taq 酶、比较好的模板质量,更需要高质量的引物对。想要 得要...
如何稀释实时
荧光定量PCR
的
引物
?
答:
对任意
PCR引物
,正确加水体积应为V(ul)=N (nmol)*10,即浓度为100uM. ie,9.96*10= 99.6ul 注:一般情况下,所有PCR引物的stock concentration都是100uM. 使用时将其稀释十倍为10uM进行PCR反应。另:拿到PCR引物后,应先13.2k rpm离心一分钟,加入65摄氏度预热ddH2O配置成100umol溶液,再65...
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