荧光定量PCR引物为什么要跨内含子设计

Question

荧光定量PCR引物为什么要跨内含子设计，大家都说是为了避免提RNA时残留基因组的干扰，但是即使跨了内含子，假如有基因组残留，Real time PCR中还是能P出比cDNA大的一条带（含内含子的条带），探针同样会结合这条大的片段，不会只结合小的片段，还是会干扰定量，除非引物只能扩增cDNA，不能扩增基因组，那就不存在基因组的干扰了。很困惑，请各位指教。非常感谢。

Answer 1

引物若跨内含子的话，引物仅能以3'端的一小部分结合基因组DNA，这样的话Tm会很低。在较高的退火温度下，引物几乎无法和基因组DNA结合来引发聚合，而主要是与能够完全配对的cDNA结合并引发反应。

Answer 2

避免基因组DNA的影响。荧光定量PCR的扩增区段比较小，也就200bp左右，而且一般以cDNA为模板。如果不注意引物设计的话，很可能落在同一个外显子内。此时，无论cDNA还是基因组DNA都会给出同样的信号，也就是说定量会出现误差。如果引物跨内含子，则cDNA会给出信号，而基因组DNA由于引物无法完全配对而没有信号，也就避免了基因组DNA的影响。

Answer 3

这个跨内含子是指引物设计在两个外显子连接处，这样就不能以genome为模板。