考马斯亮蓝法测蛋白质含量

Question

如题所述

Answer 1

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理、步骤及注意事项

1、原理

考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质—染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

2、步骤

制作标准曲线取7支试管，按下表平行操作。试管编号 0 1 2 3 4 5 6标准蛋白溶液（mL） 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04考马斯亮蓝试剂（mL） 5mL摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

3、注意事项

在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 

利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。