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westernblot上样原则
westernblot
实验步骤
答:
在RIPA蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂(根据说明书确定加入量)2.研磨:提前在离心管中分装300μLRIPA蛋白裂解液并放入2颗研磨珠,称取100mg左右样品,置于匀浆机中充分研磨;3. 蛋白裂解:将样品置于冰上裂解2h,期间于涡旋振荡器上震荡2-3次;4. 蛋白收集:将裂解后的样品4℃...
western上样
量10ug可以吗
答:
可以。1、抗体灵敏度:
Westernblot
实验中使用的抗体具有较高的灵敏度,能够检测到低浓度的抗原,因此,即使
上样
量较低,抗体也能够识别并结合目标抗原,形成免疫复合物。2、蛋白纯度:在Westernblot实验中,目标蛋白是从复杂的蛋白质混合物中分离出来的,蛋白纯度较高,那么即使上样量较低,也能得到较好的...
westernblot
试验中遇到的问题,希望能帮到正在苦恼的你~
答:
25. 若样品存在降解,应提高
上样
量;适当增加封闭时间,延长一抗孵育时间;选择合适的封闭液,如5%脱脂奶粉或5%BSA;使用磷酸酶抑制剂;确保样本操作低温,使用新鲜样品,避免反复冻融。26. 若条带不清晰,可加大上样量,调整抗体比例,提高转膜效率。27. 若背景过高,可降低抗体比例;在封闭液中加入...
westernblot
内参GAPDH成功了
视频时间 1:40
western blotting
的过程和原理
答:
WesternBlot
原理、显色分类及操作步骤一、原理与Southern或Northern杂交方法类似,但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物...
溴酚蓝的配置方法
答:
溴酚蓝的配置方法:将酚红溶于冰乙酸中,加热至沸,滴加溴溶于冰乙酸中的溶液,黄色固体析出时,过滤,用乙酸洗去游离溴,置于空气中干燥后即得粗品。用冰乙酸或丙酮与冰乙酸混合溶剂重结晶,得纯品溴酚蓝。溴酚蓝是一种pH指示剂,在pH3.0~4.6范围,颜色由黄变蓝。pH=3.0时呈黄色,pH=4....
做
western
跑电泳时加样孔里为什么会有残留的蓝色
答:
做
western
跑电泳时加样孔里会有残留的蓝色,是因为有残留的溴酚蓝没有跑下去 可能的原因是部分样品未完全溶解有沉淀,沉淀也被溴酚蓝染色,故电泳时加样孔里为什么会有残留的蓝色 这对做western并没有影响,可以直接把浓缩胶部分切掉只做分离胶部分的转膜 那么残留的蓝色就不会影响到转膜的效果 ...
westernblot
用到的Tween-20是什么?
答:
2. Tween-20具有复性抗原的作用,能有效提高特异性的识别能力。在
Western blot
实验中,使用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点,可以降低抗体的非特异性结合。理想的封闭剂应能封闭所有未结合位点,同时不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的标位,也不与抗体或检测试剂发生交叉反应。3. Tween-...
如果要分离一个抗菌蛋白需要哪些步骤啊?
答:
3.真空抽干蛋白质沉淀5~10分钟,用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50℃温浴使其完全溶解,不溶物2~8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于
Western Blot
或-5至-20℃保存备用。注意事项:1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2~8℃一个月以上或-5至-20℃...
westernblot
内参蛋白什么时候加
答:
内参检测的时候加。在WB实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白
上样
电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等常规步骤以外,还需要极其关键的一步,那就是内参检测,通过内参蛋白的表达量作为参照,校正蛋白定量和上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。
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