1943年2月，山本再次将旗舰移至更加豪华的“武藏”号。在这艘堪称世界一流的战列舰上，山本推出“伊号作战”计划，准备在南太平洋再次组织大规模的反击。谁也没曾想到，山本竟会在这次精心策划的战役中丢掉了性命。1943年4月7日，联合舰队按计划发起第一次攻击，由于日军战斗力的下降和美海军的有力防御，日军没有达到目的。为了不使山本失望，飞行队长竟然谎报战功，使山本误认为“伊号作战”旗开得胜。在以后的4天中，空中作战部队继续夸大战果。为了鼓舞士气，慰问将士，就在原计划的最后一天，即4月13号，山本突然决定视察部队。这一提议当即遭到部下的坚决反对。可是，一意孤行的山本很少听从别人的劝阻。4月18日，按照事先安排。山本率视察队伍登上了前往巴莱尔的飞机。此时，准确截获了山本行动情报的尼米兹上将早已布下了天罗地网。9点34分，在4架P－38“闪电”式战斗机的猛烈炮火下，视察人员的座机相继坠落。
美机围歼山本五十六，第二天，日军搜索部队找到了失事地点。只见山本坐在飞机的座垫上，左手握军刀，套有白色手套的右手也按在军刀上，左胸流着血。山本的军医长高田六郎少将倒卧在旁边，两具尸体都已生蛆，臭气冲天。
据后来推测，山本临死时的情景可能是：飞机坠毁后，高田还没死，他把山本拖出机舱，经过匆忙的整容后，自己也断了气。4月20日，海军少佐军医田渊义三郎写下下面的尸检报告：“左肩肿骨的中央部，有一个食指大小的子弹孔，子弹的走向是右前上方；左下颌角有一个小手指肚大小的子弹射入孔，出口在右眼外眼角，像拇指压痕一样大小，显然系因损伤主要内脏器官而致命。”
1943年5月21日，日本政府发布了山本的死讯，追授他大勋位、功一级、正三位和元帅称号。6月5日，山本的国葬仪式在东京举行。仪式之后，骨灰一分为二，一部分安葬在东乡平八郎的墓旁，一部分由他的姐姐高桥嘉寿子带回故乡长冈长兴寺。
山本五十六果然如他信中所说，在百日内就结束了自己的生命，但他在太平洋战争和珍珠港犯下的罪恶却使爱好和平的人们至今思之犹痛。