关于免疫印迹western blotting的若干愚昧问题

Question

1.为什么一定要转膜，不能用SDS凝胶直接和抗体结合吗？
2.为什么用过一次抗体结合后，还要用抗抗体结合一次呢？不能就用一次抗体吗？
3.有没有一本专门讲述免疫印迹的书呢？
请回答的大侠务必提供参考资料哦。

Answer 1

1.转膜有两个原因，最主要的原因是凝胶里的蛋白质吸附是非常疏松的，在封闭和包被抗体的时候你的蛋白都会掉下来的。只有用膜牢牢吸附住才能把蛋白固定下来。
另外，聚丙烯酰胺凝胶的强度实在是太差了，根本经不起后面封闭，砸抗体，显影等的操作，一扯一晃会散架的......就算不散架也会有很严重的变形。
还有就是把内部的蛋白转出来，转到膜的表面可以增加吸附抗体的效率。不过要说蛋白质在凝胶中完全不暴露在外有点过头了，蛋白质一般比DNA分子量小，带的电荷也少，扩散更容易，其实是能够结合外面的抗体的。但是转到膜的表面能增加效率是一定的。

2.很久以前最原始的Western办法是只用一次抗体的。只用一次抗体的缺点是，这个抗体必须定制，就是说要做什么蛋白的Western就得手工在它的抗体上接上HRP辣根过氧化物酶，每次Western的抗体不同，就得重新构建一次抗体。
蛋白重组是个技术活，做起来不容易，成功率也不高。每做一次Western都得先干一两年的蛋白重组的活，这周期和成本也太恐怖了！
所以后来就对构建HRP的抗体进行批量化工业化生产，想到的办法就是我的抗体不需要每次针对一个新的蛋白啊，只要针对某一大类的IgG就行了，再用这类IgG中的不同靶向的抗体株去结合不同的蛋白质。这样，抗体跟HRP的结合变成了批量化工业化生产，把Western实验的成本和周期大大降低了。

当然，二抗还有一个好处，就是级联放大，砸第二次抗体可以把信号再次放大成百上千倍，能大大提高整个实验的灵敏度。

3.我是在南大读硕士，我们很少看别的书，就是看《分子克隆》（科学出版社，J.萨姆布鲁克DW拉塞尔著 黄培堂等译）一本

Answer 2

1. protein在凝胶里边是不暴露在外的，而是在凝胶内的。你要是切过DNA胶，你就能明白。所以要transfer到membrane上以使其暴露于抗体；
2. 一抗制备，比方说兔子吧，你先给兔子喂一些你想要probe的蛋白，兔子就对这外源蛋白起免疫反应了，就产生抗体了。然后你让兔子流血，从血里边提取抗体。这个就叫一抗。这个一抗是和你要probe的蛋白特异性结合的，没错吧。但是你怎样用你自己的眼睛来看这个特异性识别呢（"显色"）。这就需要二抗了。二抗就能和一抗特异性结合（一般要是兔子产的一抗，就用anti-兔子的二抗；老鼠的就用老鼠的。）为啥二抗能显色，take home for you, 就是想想为啥二抗会显色^^； 总之，一抗是和靶蛋白特异性结合；二抗和一抗结合以此来显色。
3. 你看wiki就足够了（英文版）。本回答被提问者采纳

Answer 3

你这问题就像你不是学生物学的一样呵呵