western blot跑不出条带，是什么原因啊？

Question

才学做western blot ，老是出现状况，要么跑出来的条带缺一条，要么一条都没有，只是偶尔运气好跑出完整的条带，感觉步骤都是和老师教的一样啊，请各位高手帮我分析一下可能存在的原因？谢谢啊，急得不行了。这两个月徒劳无益，真是急死人了。
我做的是actin，cyclin合成cdk4.蛋白量40-70kb，浓缩胶10%，分离胶5%。
电泳60v,30h.120v,50h.转移100v,1h，当中用冰降温.
封闭1.5小时，1抗孵育2h，最近温度较低10度左右，室内空调开至25度。洗10min，3次。2抗1小时，洗30min，显影5min。
封闭液用的脱脂奶粉，通常是添加奶粉到5ml刻度线，然后加TBST到50ml
TBST其PH7.5左右
另外用的膜在甲醇过了一下，和滤纸，海绵以及后面切下来的胶（绝对没有切掉目的蛋白）都用转移缓冲液平衡过的。----------其实步骤没得挑剔，因为老师也是这样做的！！就是结果不一样！！！
啊啊！上面有写错的地方，是cyclin，actin和cdk4&电泳60 v,30min;120v,50min
转膜的时候已经排除气泡
电泳的时候只管电压没有注意电流，其实样品真的是在-20度冻了很久才做，有的是做过一次了，buffer也事先欲了冷的，转膜的过程中也没有出现接触不好的情况，转膜前膜用转移buffer泡过的，一抗稀释1：2000，ECL曝光1，5，10min我都试了的，没戏

Answer 1

　　转膜的问题，膜和胶之间有气泡等。
　　Westernblot法即是一种将电泳与KIJSA结合起来的技术，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定方法。
　　生物大分子印迹法实际上是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶电泳已分离的区带转移并印迹于固定化纸上。
　　生物大分子印迹法始创于1975年，内苏格兰爱丁堡大学E.M.Southern首先提出。他将限制酶切后的DNA片段先进行琼脂糖凝胶电泳，把一张硝酸纤维素纸放在凝胶上，利用毛细作用原位凝胶中的DNA八片段转移到硝酸纤维素纸上使之固定化。由于这种技术类似用吸干作品上的墨迹，使吸墨纸染上墨迹而被称为印迹法(blotting)。
　　1979年，Towbin等人利用电洗脱装置作为印迹动力，首先把Westernblot法用于抗原捡出，并称之为免疫印迹法(immunoblotting)。对应于Southern(DNA分子杂交)、NoHhern(RNA分子杂交)。
　　1981年Burnette把免疫印迹法称为Western blotting即蛋白质印迹法-Westernblot法。

Answer 2

1.我就问一下，你电转的电压及电流是多少，一般恒流200mA，100V，你的那个分子量2.5个小时应该可以了，多了也没大碍，PV膜的孔径是多少？你在电转前有没有用电转液把胶泡一下，去除SDS
2.一抗时间有点少，你一抗1：1000？还是多少，可以试试4度过夜。
3.二抗时间有点少，2个小时一般，冬天可以四小时
4.你用的是化学发光发吧，曝光时间是多少，一般50微克上样的话10min左右

Answer 3

估计是转膜的问题，因为你有时候有条带，说明抗体是好的。你看看转膜的时候有什么问题，是不是膜和胶之间有气泡什么的。
额。。。这，你看看上抗体的时候是不是摇床上摇的够匀，另外，延长一下上抗体的时间试试

Answer 4

1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；
2、转膜 湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。

顺带一提，步骤一样不一定成功的，有时候是操作不到位所致本回答被提问者采纳