DNA序列是怎么测量出来的?

如题所述

大致过程也是先把 DNA 切成短序列模板,然后把这些短序列都放固定到要成像的 chip 上,每个短序列都是一个 polony,就是说在 chip 占据一个位置,在这个位置上固定的是一批通过 PCR 复制的这段序列的克隆。  
然后就跟传统方法一样,配对生长,每长一个核苷酸,就成像一次,在图像上看就是无数的小点,每个小点对应一个 polony,回头通过分析就是这个 polony 对应序列的一个核酸(其实具体的技术还很不同,这么说太粗了)。这样生长下去,就能把每个 polony 的序列给测出来了。  
好处当然是因为高通量,所以一下子就把一个基因组就测了(理论上)。缺点是,每个序列长度都短:长 polony 时,每一步都会因为种种问题,有些序列模板长不下去了,信号也会变弱。最后得到的序列长度相对传统方法就短一些。  
短的问题是,它很难作 de novo 的测序,就是说,因为短序列之间的交叠太少,就无法从短序列合成出全部基因组(事实上,就是传统的 sanger 法,在染色体末端,因为有大量的重复序列,也是无法很好的测出的,所以人类基因组推出时,这段是没有的)。所以只能拿旧方法测出的全基因组作参考序列,把短序列对上去(alignment)。这样,也是越长,对得越准,出现不确定结果的可能越小。  
类似的问题是,测序终归是要看这序列与已知序列的异同,就要面对有很多不同,短序列对很多基因变异的检测能力会下降,比如染色体的倍增这样的。  
另外的问题是 coverage,就是说用这种高通路方法,生成的以亿计的 polony,看上去看多,但可能还是会错过部分基因组,而在某些部分有很多的短序列覆盖。早期的方法,好像是能覆盖 80%,也就叫全基因组测序了。

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第1个回答  2017-11-23

next generation sequencing:
相信大家还记得人类基因组计划,这计划从1990年开始到05年基本完成,用的就是sanger测序法。但是这个方法是在是太费时费事,而且消耗巨大的资源。于是各种next generation sequecing方法应势而生。

这篇文章里的这些技术不但更快捷,更便宜,而且更重要的是它是一种更直接和广泛地研究生物的方法--
Nathan Wolfe在他的研究中利用了测序技术测得在人体鼻子中的所有DNA序列,发现竟然有20%是未知的----他们不属于人类以及已知的细菌和病毒。

第2个回答  2017-11-22

最原始的方法是Sanger法:
在分子生物学研究中,DNA的 序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法(Chain Termination Method)。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G 结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得可见的DNA碱基序列。
利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
更进一步,就是用毛细管电泳代替跑胶,但原理基本不变
将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离,跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP(4种双脱氧核糖核苷酸)荧光标记不同,计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A,T,G,C中的哪一个。

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