第1个回答 2019-08-03
考马斯(Comessie)亮兰结合测定蛋白质浓度
考马斯亮兰结合近发展起蛋白质定量测定本具操作便、快速、干扰素少特点
【原理】
考马斯亮兰能与蛋白质疏水微区相结合种结合具高敏性考马斯亮兰G-250
光吸收峰465nm与蛋白质结合形复合物其吸收峰改变595nm考马斯亮兰G250-蛋白质定量测定高敏性度
定范围内考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色595nm光密度与蛋白质
含量呈线性关系故用于蛋白质含量测定
【操作】(量)
()标准曲线制备:
配制lmg/ml标准蛋白溶液制备系列稀释液其浓度别1000μg/ml500μg/ml
250μg/ml125μg/ml
62.5μg/ml31.25μg/ml
按表操作:
摇匀室温静置3钟第管照管721型光光度计于波595nm处比色-读取光密度各管光密度纵座标各标准品浓度(μg/ml)作横座标作图标准曲线
(二)未知品测定:
取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶加理盐水至刻度摇匀(品稀释200倍)
取试管二按表操作:
摇匀静置3钟721型光光度计亡波595nm比色读取光密度查标准曲线求稀释品蛋白质浓度
【计算】
未知品蛋白质浓度μg/ml=稀释品浓度×稀释倍数
【优缺点】
(-)操作简便、快速;检测灵敏;重复性
(二)显色迅速约于2钟内完染料与蛋白质结合所现颜色至少l内稳定
(三)与改良Lowry氏相比干扰物质较少
(四)品存较量十二烷磺酸钠(SDS)、TritonX-100等垢剂显色反应受干扰品缓冲液呈强碱性影响显色故必须预先处理品
(五)考马斯亮兰G250染液宜久存1-2月宜
(六)微量测定蛋白含量范围1-10μg;量测检测范围10-100/μg宜
【器材】
()试管l0支
(二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支
(三)721光光度普通比色杯4
【试剂】
()O.9%NaCl
(二)待测血清
(三)标准血清
(四)染液:考马斯亮兰G250
0.1克溶于0.5
m1
95%乙醇再加入100m1
85%(W/V)磷酸加蒸馏水定容1000ml[溶液0.0l%考马斯亮兰G250/4.7%(W/V)/乙醇/8.5%(W/V)磷酸]