bradford法测定蛋白质含量的原理是什么?应如何克服不利因素对测定的影响

如题所述

bradford法测定蛋白质含量的原理是考马斯亮蓝G250与蛋白质结合可以显色,用分光光度计在吸光度595nm处读数,通过标准蛋白与G250结合显色建立标准曲线,再加待测蛋白与G250结合显色后读数代入标准曲线测定蛋白质含量。

不利因素主要是特殊蛋白的结构,缓冲液组分中有干扰试剂等。

双缩脲法和Folin—酚试剂法的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋。取6支试管分别标号,前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,不加标准蛋白溶液,每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致。

扩展资料:

双缩脲法:首先利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线,将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合,并用只加入硫酸钠不含血清的试管作为对照,将两支试管加入等量的双缩脲试剂,充分混合后于37℃环境中放置10分钟,在540nm波长进行比色,以对照管调零,读取吸光度值,由标准曲线上直接查出蛋白质含量。双缩脲法常用于0.5g/L~10g/L含量的蛋白质溶液测定。

参考资料来源:百度百科-蛋白值测定

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第1个回答  2020-11-05

采用Bradford法,即考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。原理是考马斯亮蓝在电离状态下呈现棕红色,最大吸光量为488nm。当与蛋白质结合时,它变成蓝色,并且蛋白质与色素结合时在波长595nm处吸收光最大。其吸光值与蛋白质含量成正比,可用于蛋白质的定量测定。

蛋白与考马斯亮蓝在2min左右达到平衡,反应非常迅速。粘结剂在室温下保持稳定1h。该方法制备的试剂简单,操作方便,反应灵敏度高。灵敏度比Lowry法高4倍,可测定微克水平的蛋白质含量。主要的不利因素是特殊蛋白的结构和缓冲液中的干扰剂。

扩展资料:

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程:

1、Bradford浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml85%的磷酸,然后,用蒸馏水补充至200ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定。

2、标准曲线蛋白质样本的准备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

3、将待测样本溶于缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。

4、按1:4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,如出现沉淀,过滤除去。

5、每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5~30min。染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度。注意,显色反应不得超过30min.

6、根据标准曲线计算待测样本的浓度。

注意:该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

参考资料来源:百度百科-考马斯亮蓝法

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第2个回答  推荐于2017-10-12
bradford法测定蛋白质含量的原理是考马斯亮蓝G250与蛋白质结合可以显色,用分光光度计在吸光度595nm处读数,通过标准蛋白与G250结合显色建立标准曲线,再加待测蛋白与G250结合显色后读数代入标准曲线测定蛋白质含量。
不利因素主要是特殊蛋白的结构,缓冲液组分中有干扰试剂等。本回答被提问者和网友采纳
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