怎样储存纯化蛋白质，4摄氏度和零下20度哪一种能长时间保存蛋白质活性？

Question

在一个老美的实验室打工，做的是病毒DNA在细菌内扩增后的蛋白质提纯。通常是用尿素提纯完以后，应该用什么温度储存更合适？求指点！

Answer 1

一般来说蛋白都放在-20℃冰箱里，有必要的话甚至要放到-80摄氏度，因为你在提纯的过程中没法做到无菌，因此提纯的蛋白液里肯定共有细菌的存在。而细菌在4°C中仍然是会活动的，这样它就会去水解蛋白质，辛辛苦苦提的蛋白也就质量下降。不信你可以把蛋白放在4度里过一个星期，拿出来绝对臭了，臭了就说明降解了。

蛋白质因为其三级，四级结构复杂，一般不推荐反复冻融，这样可能极大损害蛋白活性。而且在保存时最好加入一点BSA，一般0.1%左右即可。

希望能够帮到你~有问题一起讨论解决哦~追问

谢谢，这个加BSA我之前也听说过，还请问你说的这个有文献支持吗，这样更容易说服老板。另外我们这个纯化蛋白浓度不是很高，不知道会不会对活性有影响。还有一种说法是加甘油，可是洗脱困难，我有点不是很理解这个原理。

Answer 2

蛋白质纯化后保存不好的话，很容易失活，据一位有经验的老师建议，4度和-80度保存，-20度保存等于白搭，效果不会比4度好到哪里去，最好是保存在-80度，据说是-80度保存一个月后活性下降一半吧，其他的会更快。自己没试过，这仅是我一位专业做蛋白老师给的建议。希望对你有帮助。

Answer 3

尿素提纯？你做refold?纯化的蛋白应该液氮或者干冰乙醇速冻，然后置于-80 freezer。4度肯定不适合长期保存，而蛋白保存应该速冻，减少蛋白在慢速温度变化过程中的构象改变。-20也不足以维持蛋白的构象。追问

谢谢！关于液氮和干冰乙醇速冻有具体的方法吗，最好是有文献支持。

追答

这个做生物物理的人都知道。当你研究一个蛋白的“温度--比热容”变化曲线，会发现即使在4度到20度的缓慢变化中，蛋白的热容还是会有改变，反映出来就是熵值会改变，这就表明蛋白的构象会发生变化，从而可能发生变性，失活，蛋白构象不均一等问题。因此速冻是为了让蛋白的构象来不及改变，而保存于-80也会使蛋白基本保持稳定。当然对于做蛋白晶体学的来说，最理想的是用新鲜纯化的蛋白。对于加甘油保持蛋白稳定性的办法在activity assay里无可厚非，记住做对照就行，对于晶体学来说，甘油是cryoprotectant，不利于长晶体。解决洗脱困难，你可以在buffer里加入少量甘油，然后在承接elution的容器中预先加入甘油，这个也是有很多不稳定的酶是这么纯化的，比如TEV，容易aggregate，就是这么处理。
另外，怕4度保存长菌降解的话，可以用0.2um的膜过滤除菌，或者在elute buffer里加sodium azide。但是只能保存较短的时间，平均两三天就是上限了。
你老板为啥这种常识都要文献支持，老板是做生物的不？
先回答这么多，有问题可以追问。

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Answer 4

最好-80。为避免反复冻融，可根据用量分装。

Answer 5

我们一般是把蛋白质冻干以后在-20°保存，活性可以保持一年左右，追问

可以解释一下“冻干”吗，刚开始做，跟文盲差不多，谢谢啦！

追答

就是将你得到的蛋白溶液分管然后用冻干机进行冻干，冻干简单点儿说就是将溶液状态的蛋白进行抽真空转变成干粉状态，这样更加易于保存。