内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western
Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。
内参即是内部参照（Internal
Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由
管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping
Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做
参照物。在Western
Blotting
实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在Western
Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞
中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否
完全、整个Western
Blot显色或者发光体系是否正常。
在Western
Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、
超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip
缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。