请问台盼蓝染色(区分死细胞与活细胞)和结晶紫染色的染液的配制方法以及...

Question

如题所述

Answer 1

一、台盼蓝染色配制与步骤：
- 配制：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加0.9% NaCl至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。使用时用生理盐水或PBS稀释至所需浓度。
- 步骤：
1. 用胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并适当稀释。
2. 将细胞悬液与台盼蓝溶液按9:1比例混合均匀。（最终浓度约为0.04%）
3. 计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
4. 镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
5. 统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数 /（活细胞总数+死细胞总数）×100%。
二、结晶紫染色配制与步骤：
- 配制：结晶紫2.0克，草酸铵0.8克，95%酒精20毫升，馏水80毫升。先将结晶紫溶于酒精，草酸铵溶于蒸馏水中，然后将两液混合，静置48小时使用。该染液稳定，置于密闭的棕色瓶中可储存数月。
- 步骤：
1. 在96孔细胞培养板各孔中加入0.1毫升含5×10^4至10×10^4 WEHI-164细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃，5% CO2的二氧化碳培养箱中培养2至3小时，让细胞贴壁。
2. 用RPMI-1640培养液按10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3至5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1毫升稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照孔各加0.1毫升含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18至24小时。
3. 甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1毫升10%甲醇溶液固定细胞30秒钟。
4. 吸去甲醇溶液，每孔加0.1毫升结晶紫染液，室温中放置20分钟。
5. 轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。
6. 测定前，每孔加0.1毫升33%醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性。