蛋白质含量测定方法有哪些?

如题所述

蛋白质含量测定方法如下:

一、蛋白质含量测定

1.双缩脲法

双缩脲是有两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180℃,则两分子尿素缩合,放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应生成红紫色络合物,称为双缩脲反应。蛋白质中的肽键与之类似,凡是具两个以上肽键的物质均会也能起双缩脲反应,形成红紫色络合物。此反应可用于定性鉴定,也可在540nm比色,定量测定蛋白含量。

2.黄色反应

含有芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的蛋白质在溶液中遇到硝酸后,先产生白色沉淀,加热则变黄,再加碱颜色加深为橙黄色。这是因为苯环被硝化,产生硝基苯衍生物。皮肤、毛发、指甲遇浓硝酸都会变黄。

3.米伦反应

米伦试剂是硝酸汞、亚硝酸汞硝酸和亚硝酸的混合物,蛋白质加入米伦试剂后即产生白色沉淀,加热后变成红色。酚类化合物有此反应,酪氨酸及含酪氨酸的化合物都有此反应。

4.乙醛反应

在蛋白溶液中加入乙醛酸,并沿试管壁慢慢注入浓硫酸,在两液层之间就会出现紫色环,凡含有吲哚基的化合物都有此反应。不含色氨酸的白明胶就无此反应。

5.坂口反应

精氨酸的胍基能与次氯酸钠(或次溴酸钠)及α萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质。此反应可用来鉴定含精氨酸的蛋白质,也可定量测定精氨酸含量。

6.费林反应(Folin-酚)

福林-酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜形成复合物,此复合物以及芳香族氛基酸残基可以还原酚试剂而产生蓝色,再与标准蛋白质(通常采用牛血清白蛋内)比色定量。

福林—酚试剂法灵敏度高,但是如果样品和标准蛋白质的芳香族氨基酸差异较大时,会有较大的系统误差。例如:酪氨酸的酚基能还原费林试剂中的磷钼酸及磷钨酸,生成蓝色化合物。可用来定量测定蛋白含量。它是双缩脲反应的发展,灵敏度高。

7.Bradford法

(1)考马斯亮蓝G-250是一种染料,在游离状态下呈红色,与蛋白质结合则呈现蓝色。在一定范围内,溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,可用比色法测定。

(2)本法试剂配制简单,操作简便,是一种常见的蛋白质快速微量测定方法,能检测微克级别。

8.胶体金

灵敏度最高,能检测到纳克水平。

二、蛋白质纯度鉴定

1.蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法。例如等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳以及沉降分析等。

2.如果制品是纯的,在这些分析的图谱上只呈现一个峰或一个条带。

3.任何单独一种鉴定只能认为是蛋白质分子均一性的必要条件而不是充分条件。

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