，第一次做荧光定量PCR，内参基因可以跑出来，但是荧光峰度比较低，溶解曲线也不错，但目的基因完全跑不出

Question

目的基因在普通PCR仪上，可以跑出来，跑电泳条带清晰，引物二聚体不明显。但是在realtime-pcr上没有扩增的荧光曲线。而且溶解曲线没有明显的峰。模板浓度从10倍稀释，5倍稀释，到2倍稀释都做了，内参基因都可以，不错荧光峰度都较低，目的基因一直没有扩增的荧光曲线。想不明白了，求解救！ 。。坐等解答。。

Answer 1

朋友，首先跟你说一下我的经验，其实这里有个误区，其实普通PCR对Realtime PCR的指导意义实在是太小，因为realtime PCR的引物跟普通PCR的引物有很大差别，realtime PCR的引物因为要顾及试验体系的要求，所以在引物性能方面有一些牺牲，比如有时候要求180-200bp的扩增需要会牺牲一些性能，比如存在二聚体之类的东西。溶解曲线没有明显的峰说明没有扩增产物，这里面问题很多，比如温度条件、引物条件等等，最好还是能够找公司帮你设计引物，比如takara等公司，可以帮你设计引物。再有一个问题，你说你的模板稀释倍数越来越小依然没有产物，你觉得困扰，其实并不是像你想的那样，按照你的思路，你扩增产物应该是丰度比较低的产物，这样的扩增反应你认为模板量越大越好，其实不然，因为反转录buffer和realtime buffer是不同的，而且反转录体系的一些组分能够抑制realtime反应的进行，因此，可能你稀释倍数越低，最后反而realtime反应的扩增效率越低，你可以尝试把稀释倍数高一些试试看，因为当时我在做实验的时候确实在丁香园上看到有的战友提到过这样的问题，如果再有问题我们可以再讨论，大家一起提高，希望能帮到你。