蛋白质组学样品前处理的方法

Question

如题所述

Answer 1

要回答这个问题，首先需要理解样品前处理需要达到的目的：减少人为降解和修饰，并且尽量多的释放肽段。

整个过程可以分为以下流程：先从组织、体液或细胞中提取蛋白质，拿到蛋白混合溶液（根据你的研究目的，可以对蛋白先做分离，或者不分离），接下来还原烷基化（还原的过程是将蛋白的二硫键打开，然后烷基化可以修饰巯基，防止游离的巯基再生成二硫键）处理，并酶解成肽段。

1，样品的收集与保存

组织样品

1) 对于人体手术切除的组织，有条件的话，最好用PBS（磷酸缓冲盐溶液，作为溶剂，起溶解保护试剂的作用）取完之后直接去血。如果没有去血，可以-80℃液氮保存，干冰运输。

2）对于小鼠、大鼠、兔子之类的组织样品，建议用灌流的方式来去血，尤其是像肝脏、胃、心脏这类大的组织，可以直接用灌流的方式去血，去得最干净。其次的方案是在后期剪碎的时候去血。

细胞样品

常规实验，建议收到5*1E6~1E7个细胞以上的样品量（有些实验需要的样品量会少一些，后面会详细讲）。细胞取好后，首先用PBS清洗一下细胞表面，因为大部分培养基里面都含有血清，这部分血清得洗干净了先~

如果是做分泌蛋白研究的话，首先用PBS清洗样品几次，再用条件培养基（不含有血清的培养基）进行培养，根据细胞情况，大概12个小时以后，离心，去掉细胞碎片，取上清，就能提取到分泌蛋白了。

血清样品

1）血浆样品：可以通过医院常用的EDTA抗凝管进行收集，收集到的血浆会呈悬浮状态，离心去掉血细胞。

2）血清样品：现在大部分研究都直接针对血清样品，它的成份更简单，没有凝集素，没有大量的血细胞，针对性会更强。收集血清样品时，直接把血清吸到管子里，室温静置让它凝结，上清黄色部分就是血清样品啦。
2，研磨或超声破碎样品，为了减少人为操作引入的修饰，通常会准备大量的冰，进行冰上的操作。同时还需要加入蛋白酶抑制剂，防止在操作过程中蛋白被样品中自带的蛋白酶降解掉。

3，充分熔接蛋白质，如果蛋白没有充分溶解，能提取到的蛋白就会很少，达不到研究目的。

4，充分解旋蛋白质，通常，蛋白质都是成球状的稳定状态，解旋蛋白质就是将球状蛋白中的二硫键打开，让它形成链状结构，以便进行下一步酶切。

5，酶解蛋白质，一般会用多种酶对蛋白质进行酶解。

6，去除杂质，我们要知道，质谱是一个非常灵敏的仪器，它检测的是多肽的质荷比。所有的盐类，以及所有会进行离子化的杂质，都会干扰到肽段的检测。所以我们会要求进入质谱之前的蛋白样品非常干净。在蛋白水平及肽段水平都会进行去除杂质的步骤。

更详细的，下次再聊~

Answer 2

　　溶剂提取法
　　同一溶剂中，不同物质具有不同的溶解度。利用混合物中各物质溶解度的不同将混合物组分完全或部分分离的过程称为萃取，也称提取。常用方法有以下几种。
　　(一)浸提法
　　浸提法又称浸泡法。用于从固体混合物或有机体中提取某种物质，所采用的提取剂，应既能大量溶解被提取的物质，又要不破坏被提取物质的性质。为了提高物质在溶剂中的溶解度，往往在浸提时加热。如用索氏抽提法提取脂肪。提取剂是此类方法中重要因素，可以用单一溶剂，也可以用混合溶剂。
　　(二)溶剂萃取法
　　溶剂萃取法用于从溶液中提取某一组分，利用该组分在两种互不相溶的试剂中分配系数的不同，使其从一种溶液中转移至另一种溶剂中，从而与其他组分分离，达到分离和富集的目的。通常可用分液漏斗多次提取达到目的。若被转移的成分是有色化合物，可用有机相直接进行比色测定，即萃取比色法。萃取比色法具有较高的灵敏度和选择性。如双硫腙法测定食品中的铅含量。此法设备简单、操作迅速、分离效果好，但是成批试样分析时工作量大。同时，萃取溶剂常易挥发，易烧．且有毒性，操作时应加以注意。

　　盐析法
　　向溶液中加入某种无机盐，使溶质在原溶剂中的溶解度大大降低，而从溶液中沉淀析出，这种方法叫做盐析。如在蛋白质溶液中加入大量的盐类(硫酸铵)，特别是加入重金属盐，使蛋白质从溶液中沉淀出来。
　　在进行盐析工作时，应注意溶液中所加入的物质的选择。它应是不会破坏溶液中所要析出的物质，否则达不到盐析提取的目的。

　　化学分离法
　　(一)磺化法和皂化法
　　这是处理油脂或脂肪样品时经常使用的方法。例如，残留农药分析和脂溶性维生素测定中，油脂被浓硫酸磺化，或被碱皂化，由疏水性变成亲水性，使油脂中需检测的非极性物质能较容易地被非极性或弱极性溶剂提取出来。
　　(二)沉淀分离法
　　沉淀分离法是利用沉淀反应进行分离的方法。在试样中加入适当的沉淀剂,使被测组分沉淀下来，或将干扰组分沉淀除去，从而达到分离的目的。
　　(三)掩蔽法
　　利用掩蔽剂与样液中的干扰成分作用，使干扰成分转变为不干扰测定的状态，即被掩蔽起来。运用这种方法，可以不经过分离干扰成分的操作而消除其干扰作用，简化分析步骤，因而在食品分析中应用十分广泛，常用于金属元素的测定。