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如何设计荧光定量的引物
荧光定量
PCR(qPCR)——
引物设计
篇
答:
首先,
引物设计需跨越内含子,确保扩增产物只来自cDNA,消除gDNA污染可能带来的干扰
。其次,引物长度应控制在18-30nt,产物长度保持在100-300bp,避免太短导致非特异扩增,过长则可能形成二级结构影响PCR效率。引物的GC含量应保持在40%-60%,Tm值建议在55-65℃,上下游引物尽量接近,避免3'端末端选择A,...
普通pcr引物设计
和
荧光定量
pcr引物设计的区别
答:
1、普通pcr引物设计:为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列
。2、荧光定量pcr引物设计:在PCR反应体系中加入荧光基团,通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程,然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中,对全程PCR扩增过程进行实时检测,根据反应时间和荧光...
如何设计荧光定量
PCR
的引物
及TaqMan探针
答:
2,
引物
末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。3,将引物尽量接近于探针 d循环参数 当引物和探针按照上述原则
设计
好后,循环的参数也就确定了,当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定),反应要经过95℃,15-20秒,60℃60秒,对于一些模板,45秒也足够了。数据在退火时检测。e)
怎么
优化探...
实时
荧光定量
PCR中两种
引物的设计
有什么要求
答:
10. 引物3′端要避开密码子的第3位
。11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150bp最好,最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染,最好跨外显子接头区。14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好...
荧光定量
PCR
的引物怎么设计
答:
1、查找该物种或近缘物种信息,看是否能确定内含子序列的位置,在CDS上设计跨内含子的引物,以避免基因组污染
;2、扩增片段大小最好在200bp左右,太大会影响扩增效率;3、最好一次分别设计两条上游(距离较近)和下游引物(距离较近),组合成4个扩增片段;4、用任何方法或软件设计好的引用都要用少量...
荧光定量
PCR操作步骤
答:
- 待测样品和管家基因PCR,配置反应体系,进行实时
定量
PCR扩增。6. PCR产物分析 - 制备单一特异性扩增条带的PCR产物,进行10倍梯度稀释。- 实时定量PCR后,电泳检测产物,确认扩增结果。7.
引物设计
- 使用Primer Premier 5.0软件,
设计引物
时确保与模板互补,避免二聚体或错配。8. 结果观察 - 样品...
如何设计
sybrgreen法
荧光定量
pcr
引物
答:
3
引物
尽量接近于探针 d循环参数 引物探针按照述原则
设计
循环参数确定经起始变性温度(根据Tag酶要求设定)反应要经95℃15-20秒60℃60秒于些模板45秒足够数据退火检测 e)优化探针引物浓度 于双探针反应通选择探针引物浓度优化反应结能获低CT值及相于背景说
荧光
值高增 引物浓度应该50nM -900nM 范围内进行...
做
荧光定量
PCR,但是不知道内参的序列,如果NCBI上没有该
怎么设计
内参的引...
答:
啥都没有的话是无法
设计的
首先你可以克隆获得内参的序列,再进行下一步实验
实时
荧光定量
PCR中两种
引物的设计
有什么要求
答:
5、错配率一般不要超过100,否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为340以上,而在错误位点的引发效率为110,并且不好找到其他更合适
的引物
,那么这对引物是可以接受的;6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个...
如何设计
sybrgreen法
荧光定量
pcr
引物
答:
引物
荧光定量
PCR 是利用荧光定量PCR 仪(如ABI 7500、stepone、ROChe LightCycler、Bio-Rad CFX96 等)通过实时追踪 PCR 每一步循环的荧光信号 值来达到对起始模板量的定量分析。一次成功的荧光定量 PCR 反应除了需要稳 定的仪器、优质的 Taq 酶、比较好的模板质量,更需要高质量
的引物
对。想要 得要...
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