分离一个基因上游启动子序列的最有效技术是什么

Question

如题所述

Answer 1

分离一个基因上游启动子序列有多种方法：
1、传统文库筛选法：构建经典的基因组DNA文库（质粒、噬菌体或COS质粒载体），以基因的5‘序列为探针，筛选文库，阳性克隆子测序后就知道了其转录起始位点5’的启动子序列。如果一次文库筛选得到的启动子不完整，则以其5‘区段标记后第二轮筛选该文库，测序和分析，如此一轮一轮地进行染色体步查，终可获得完整的启动子序列。由于真核启动子序列一般也就200-3000bp左右，因此一般来讲筛选1-2轮也就够了。该方法的缺点是文库构建和筛选既费钱、费时而且技术要求高，过去用得多，现逐渐少了。
2、PCR步查法：构建无载体的基因组DNA酶切“假”文库（一般需同时做4-5种限制酶的），针对基因的5‘序列设计2条反向引物，与“假”文库的DNA片段的接头序列上的锚定通用引物配对，进行PCR扩增，经初扩、巢扩后，回收特异扩增片段，T-载体克隆后测序，即可获得转录起始位点5’的启动子序列。如果第一轮扩增获得的启动子不完整，则在其5‘反向序列处设计2条新的反向引物，与锚定引物配对，进行第二轮PCR扩增。如此进行染色体步查，终可获得全长启动子序列。
3、以电子克隆为辅助的简单克隆。以上两种方法均是针对没有完成全基因组序列测序以及目标基因所在染色体区段没有测序参考序列的情况，即暗箱情形。对于人、鼠、拟南芥、水稻等已完成全基因组测序的物种来讲，或者对于棉花、甘蓝等基因接近全测序且有大量公开的GSS或BAC序列可参考的物种来讲，均可采用基因序列进行生物信息学比对和电子克隆，进行电子步查，即使不能直接获得完整的启动子序列，也对于设计引物克隆全长启动子有很大帮助。在这种情形下设计引物克隆启动子，只是一个简单工作。

Answer 2

1.克隆含有该启动子的完整基因。
2.根据基因序列，设计引物，5‘RACE。
3.报告基因融合筛选启动子。本回答被网友采纳