根据朗伯—比耳定律，理论上吸光度对浓度作图所得到的直线的截距应该为零，斜率为εb，而实际上，吸光度与浓度的关系有时是非线性的，或者不通过零点，这种现象称为偏离比耳定律。
若溶液的实际吸光度比理论值大，则为正偏离比耳定律；若实际吸光度比理论值小，为负偏离比耳定律，如图4.5所示。
图4.5 朗伯—比耳定律的偏离
1—无偏离；2—正偏离；3—负偏离
比耳定律的偏离是由朗伯—比耳定律本身的局限性、溶液的化学因素以及仪器的因素等原因导致的。
(1)朗伯—比耳定律本身的局限性
朗伯-比耳定律只适用于浓度小于0.01mol·L-1的稀溶液。当吸收物质在溶液中的浓度较高时，由于吸收质点之间的平均距离缩小，邻近质点彼此的电荷分布会产生相互影响，以至于改变它们对特定辐射的吸收能力，即改变了吸光系数，从而导致比耳定律的偏离。
另外，摩尔吸光系数ε或吸光系数a与浓度无关，但与折射率n有关，摩尔吸光系数ε是真实摩尔吸光系数ε真和溶液折射率n的函数，即
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在低浓度时，n基本不变，ε也基本不变，服从比耳定律；在高浓度时，由于n随浓度增加而增加，ε会随之变小，因此引起比耳定律的偏离。
当入射光通过具有不同折射率的两种介质的界面时会发生反射作用。当被测溶液浓度与空白溶液浓度相差较大时，两者的差异也较大，校正曲线则不通过零点。为了校正或消除这种差异，测定时可用与被测溶液组成相似的空白溶液做相对校正，若空白溶液与被测溶液的组成相近，则被测溶液的折射率和空白溶液的折射率基本相同，反射作用的影响则会互相抵消。
(2)化学因素
推导吸收定律时，吸光度的加和性隐含着测定溶液中各组分之间没有相互作用的假设。但实际上，随着浓度的增大，各组分之间甚至同组分的吸光质点之间的相互作用是不可避免的。例如，溶液中各组分之间可以发生缔合、离解、光化学反应、互变异构及配合物配位数的变化等等，会使被测组分的吸收曲线发生明显的变化，吸收峰的位置、强度及光谱精细结构都会有所不同，从而破坏了原来的吸光度与浓度之间的函数关系，从而导致比耳定律的偏离。
若化学变化使吸光物质浓度降低，则产物在测量波长处不吸收，引起负偏离；若产物比原吸光物质在测量波长处的吸收更强，则引起正偏离。
(3)仪器的因素
从理论上来说，朗伯-比耳定律只适用于单色光(即单一波长的光)，但是紫外-可见分光光度计从光源发出的连续光经单色器分光，为了满足实际测量中需要有足够光强的要求，入射光狭缝必须有一定的宽度，因此由出射光狭缝投射到被测溶液的光束，并不是理论要求的严格意义上的单色光，而是由一小段波长范围组成的复合光，由于分子吸收光谱是一种带状光谱，吸光物质对不同波长光的吸收能力不同，在峰值位置吸收能力最强，ε最大(用εmax表示)，其他波长处ε都会变小，因此当吸光物质吸收复合光时，实际吸光度要比理论吸光度偏低，因此导致比耳定律的负偏离。在所使用的波长范围内，吸光物质的吸光系数变化越大，这种偏离就越显著。
图4.6 分析谱带的选择
例如，如图4.6 所示的吸收光谱，选择谱带Ⅰ的波长宽度作为入射光时，吸光系数变化较小，测量造成的偏离就比较小；若选择谱带Ⅱ的波长宽度作为入射光时，吸光系数变化很大，测量造成的偏离也就很大。所以通常选择吸光物质的最大吸收波长(即吸收带峰所对应的波长)作为分析的测量波长，这样不仅保证有较高的测量灵敏度，而且此处的吸收曲线往往较为平坦，吸光系数变化比较小，比耳定律的偏离也比较小。对于比较尖锐的吸收带，在满足一定的灵敏度要求下，尽量避免用吸收峰的波长作为测量波长，投射被测溶液的光束单色性(波长范围)越差，引起的比耳定律偏离也越大，所以在保证足够的光强前提下，采用窄的入射光狭缝，以减小谱带宽度，从而降低比耳定律的偏离。
(4)溶剂及介质条件
溶剂及介质条件对吸收光谱的影响十分明显。溶剂及介质条件(如pH值)经常会影响被测物质的性质和组成，影响生色团的吸收波长和吸收强度，从而导致比耳吸收定律的偏离。
当测定溶液中有胶体、乳状液或悬浮物质存在时，入射光通过溶液时，有一部分光会因散射而损失，造成“假吸收”，使吸光度偏大，导致比耳定律的正偏离。质点的散射强度与照射光波长的四次方成反比，所以在紫外光区测量时，散射光的影响更大。