生物学家在进一步研究酶以及它的特性时，观察到这样一种极为有趣的现象：不管反应物是否预先经过加热处理，在冷却后都能被酶催化；但反过来情况就不同了，先加热处理酶，冷却后再加入到反应物中去，它就没有催化能力了。
原来这是酶的一个重要特性，即对热特别敏感，极容易受热而失活。在研究蛋白质时，科学家早就知道有一类蛋白质对热也十分敏感，因此联想到酶很可能也是一种蛋白质。这种猜想后来被证实。蛋白质和酶极为相似，凡是能使蛋白质分解破坏的一切外部条件，也能同样使酶的催化能力丧失。同时，还发现酶和许多蛋白质的物理化学性质也十分相似，但当时还不能确定酶就是一种有催化能力的蛋白质。诺贝尔奖获得者德国化学家威尔斯塔特提出酶不是蛋白质的观点。他采用提纯酶的方法，使酶达到了前所未有的纯度，同时又制备了酶的高浓度溶液，对其检测，没有测出蛋白质。他因此认定，酶不是蛋白质。
到了上世纪20年代，美国科学家萨姆纳从刀豆中提取到尿素酶。这种酶可以使尿素分解为氮和二氧化碳，并使尿素酶提纯到结晶体状态。他对尿素酶进行详尽的研究，证明它是蛋白质。以后另一位美国化学家诺斯罗谱等又相继获得胃蛋白酶、胰蛋白酶等结晶体，并证明这些酶也是蛋白质。直到此时为止，酶才被确认为是一种有催化功能的特殊蛋白质。