原代细胞培养常见问题有哪些

Question

如题所述

Answer 1

原代细胞培养常见问题的原因及其解决的办法：

培养液pH值变化太快
可能原因
(1)CO2张力不对
(2)培养瓶盖拧得太紧
(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足
(4)培养液中盐浓度不正确
(5)细菌、酵母或真菌污染
建议解决方法
(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。
(2)松开瓶盖1/4圈。
(3)改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。
(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。
(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。


培养液出现沉淀，但pH值不变
可能原因
(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来
(2)冰冻保存培养液
建议解决方法
(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。

培养液出现沉淀，同时pH发生变化
可能原因
细菌或真菌污染
建议解决方法
丢弃培养物，或用抗生素除菌。

培养细胞不贴壁
可能原因
(1)胰蛋白酶消化过度
(2)支原体污染
(3)培养瓶瓶底不干净
(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)
(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当

细胞老化
建议解决方法
(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。
(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶
(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)
(5)重新配置消化液或培养液

培养细胞生长减慢
可能原因
(1)由于更换不同培养液或血清
(2)培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。
(3)培养物中有少量细菌或真菌污染
(4)试剂保存不当
(5)接种细胞起始浓度太低
建议解决方法
(1)比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液。
(2)换入新鲜配制培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子。
(3)用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。
(4)血清需保存在-5℃到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2周内用完。
(5)增加接种细胞起始浓度

培养细胞死亡
可能原因
(1)培养箱内无CO2
(2)培养箱内温度波动太大
(3)细胞冻存或复苏过程中损伤
(4)培养液渗透压不正确
(5)培养液种有毒代谢产物堆积
建议解决方法
(1)检测培养箱内CO2
(2)检查培养箱内温度
(3)取新的保存细胞种
(4)检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260– 350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。
(5)换入新鲜培养液

Answer 2

一、原代细胞与细胞系有什么区别？
根据传统定义，自组织第一次收获和接种的细胞被称为原代细胞 [Freshney,
R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New
York, Alan R. Liss, Inc.)].
这类细胞直接从组织分离，生命周期有限，经数次传代后会逐渐停止生长。原代细胞在有限的生命周期内需掌握好细胞的最大生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。
细胞系是不断生长、分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。
但实际上，经过长时间、连续的传代培养后，细胞系随着代数的增加，细胞的基因型和表型都有可能发生改变。
需要指出的是，在不同的科研小组中这些术语的定义会有所不同。许多研究员不用细胞系这个词表示细胞群，除非细胞经过了遗传改造。
二、倍增和代数有什么区别？
倍增是培养物中细胞总数的翻倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的，是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。
三、接收到的冻存细胞该如何处理？
收到包装箱后，立即将冻存细胞从干冰移入液氮中冻存。此过程尽量快，以避免升温。不要将细胞储存在-80℃，这样会对细胞造成不可挽回的伤害。

四、有多少经验才能开始正常人类细胞培养？
推荐有经验者在无菌环境下用洁净操作台工作，如果有细胞系培养经验的话，对原代细胞的培养也是很有益处的。如果你是细胞培养的初学者或打算建立细胞培养实验室，我们会为你提供帮助。请联系我们的细胞培养专家（裕恒丰科技有限公司）。
五、冻存的细胞该如何开始培养？
(1) 将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。
(2) 将冻存管快速的放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体完全融化。
(3) 将冻存管立即从水浴中拿出，擦干，转入无菌环境。
(4) 用70％的酒精冲洗冻存管，然后擦去多余酒精。
(5) 打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹（注意，由于冻存管有负压，开盖时可能会有少量溢出，这是正常现象）。
(6) 用多聚赖氨酸（或参照说明书）包被培养瓶。多数细胞推荐的接种密度为每平方厘米5000个细胞。
(7) 盖好培养瓶的盖子，轻轻摇晃培养瓶以使细胞分布均匀。若需要气体交换可打开盖子。
(8) 将培养瓶放入培养箱中（37℃，5%CO2，95%空气）
(9) 放入培养箱后第6-16小时更换一次培养基，以去除残留的二甲基亚枫和未贴壁的细胞。

六、当我第一次复苏正常人类细胞时，是否需要先离心细胞以去除二甲基亚枫吗？
第一次复苏正常人类冻存细胞时，我们不推荐离心去除二甲基亚枫。与残留的二甲基亚枫相比，离心过程对细胞的伤害更大，尤其是不适当的高速离心时。我们的经验是：如果二甲基亚枫的浓度很低，细胞不会受毒害。如果你将1ml细胞放入含15ml培养基的T-75培养瓶中，二甲基亚枫的浓度将小于0.67％，没有发现负面影响。实际上，如果细胞的接种密度为每平方厘米5000-10000个，二甲基亚枫的浓度很低。

七、细胞培养过程中，多久更换一次培养基？
这取决于细胞生长的速度。一般而言2-3天更换一次培养基，许多细胞培养实验室通常在周一，周三，周五更换培养基。
注意：冻存细胞复苏后，在6-16小时内更换培养基，以去除残留的二甲基亚枫和死亡的细胞。
八、我能扩增培养和再次冻存ScienCell的正常人类细胞吗？
这取决于细胞的类型。一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞，不推荐扩增培养和再次冻存。其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等，可以扩增培养和再次冻存。然而，需要注意的是再次冻存的过程可能导致细胞生长性能的改变。如果你想要再次冻存细胞，请亲自咨询我们的技术支持并使用ScienCell 无血清细胞冻存液（SF-CFM）和特定的无血清培养基，以获得最佳冻存效果。
九、我能长时间的冷冻保存ScienCell的原代细胞培养基吗？
我们不推荐冷冻保存培养基，高营养的培养基经过冷冻和复温后，可能导致培养基成分的不可逆降解，从而影响细胞的生长。
十、培养瓶中应该加入多少体积的培养基？
我们推荐的用量为：T-25培养瓶5ml，T-75培养瓶15ml，T-150培养瓶30ml。