光照计核酸的定量

Question

如题所述

Answer 1

分光光度计是核酸定量的常用工具，其主要功能是测量不同类型的核酸，如寡核苷酸、单链和双链DNA，以及RNA的浓度。核酸在260纳米处有最高的吸收峰，不同类型的核酸因其分子结构不同，需要选择相应的换算系数进行定量。例如，1单位的吸光度对应于dsDNA的50μg/ml，ssDNA的37μg/ml，RNA的40μg/ml，Olig的30μg/ml。在测试前，需要设置正确的程序，输入原液和稀释液的体积，先测试空白液和样品液。

然而，实验过程中，读数的稳定性有时会成为难题，尤其是对于高灵敏度仪器。尽管分光光度计的设计允许在一定范围内吸光值变动，但如Eppendorf Biophotometer的精度≤1.0%（1A），这意味着测试结果在均值1.0%内的波动是正常的。影响读数的因素包括核酸的物化性质（如pH值，离子浓度），以及样品的稀释浓度。过高的离子浓度可能导致读数漂移，建议使用pH稳定且离子浓度较低的缓冲液，如TE，以提高测试稳定性。同时，样品的稀释度不宜过高或过低，以免颗粒干扰或超出仪器检测范围。操作技巧也至关重要，如充分混合、避免气泡、统一比色杯测试、使用正确的换算系数和单位，以及使用未磨损的比色杯，确保样品体积符合要求。

除了浓度测量，分光光度计还会显示A260/A280、A230/A260、A320等比值，这些比值有助于评估样品的纯度。例如，A260/A280比值大于1.8（DNA）和2.0（RNA）表示高纯度，若比值低可能表示有蛋白质或酚类物质。A230/A260比值大于2.0则表明样品中较少含碳水化合物、多肽或苯酚等杂质。A320值接近0则表示溶液清澈，无混浊或其他干扰因素。