动物细胞培养中细胞如何冻存？

Question

如题所述

Answer 1

细胞冻存的原则是：冻存缓慢降温，复苏快速升温。不同的动物细胞稍微有点不同，下面是一般的方法：
（一）细胞冻存
　　1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
　　2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
　　3. 离心1000rpm，5min；
　　4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
　　5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
　　6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
　　7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/
　　min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
　　（二） 细胞复苏
　　1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
　　2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
　　3. 离心， 1000rpm，5min；
　　4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
　　5. 次日更换一次培养液，继续培养。

参考资料：http://baike.baidu.com/view/2946535.htm

Answer 2

简单说一下步骤
1.将70%~80%密度，生长良好的细胞用ATV消化，离心，倒掉培养基
2.用FBS清洗细胞两次，离心
3.加900微升FBS吹打悬浮细胞，并置于冻存管，向冻存管加入100微升DMSO，迅速上下颠倒混匀
4.将冻存管用医用白胶布密封，置于冻存盒中，将冻存盒置于-80冰箱，24小时后取出置于液氮长期冻存。若没有冻存盒，可对冻存管采用梯度冻存，从-20，-80，再到液氮的方法。本回答被网友采纳

Answer 3

细胞冻存
1.取待冻存的细胞用胰酶消化(见相关实验细胞传代培养部分)，用培养基将细胞冲洗下来。800 r/min离心5 min，弃上清收集细胞。如果是悬浮生长的细胞，则可直接离心收集细胞。
2.加入适量冻存液(10%甘油+90%培养基，或者10%DMSO+90%培养基)制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3×106个/mL左右，并可适量增加牛血清浓度至20%。
3.细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记(写上细胞种类、时间及冻存条件等)。
4.冻存管在4℃下存放30 min，转放-20℃ 1.5～2 h，再转人-70℃ 4-12 h后即可转移到液氮内(-196℃)，注意进行登记。

Answer 4

传代时如有少量富余细胞，应立即作为种细胞储备冻存，加以保管，不得用作常规实
验之用。利用冻存的种细胞储备可制备和补充工作细胞储备。如果种细胞储备用尽，
可利用冻存的工作细胞储备制备新的种细胞储备，这样与最初冻存时相比，细胞代数
增加较少。
对培养的细胞进行冻存的最佳方法是将细胞置于含有二甲基亚砜 (DMSO) 等冷冻保护剂
的完全培养基中于液氮中储存。冷冻保护剂可降低培养基的冰点，并可减缓冷却速度，
大大降低冰晶形成的危险 (冰晶可损伤细胞，导致细胞死亡)。
注：DMSO 可促进有机分子进入组织。操作含 DMSO 的试剂时，应采用与此类物质安全
危害相适应的设备和操作规范，并应按照当地法规处置此类试剂。

Answer 5

不知道，用压缩的氮气吧？