GB/T 5009.33-2003
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GB/T 5009.33—1996
中华人民共和国国家标准 食品中
亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法 Method for determination of nitrite and nitrate in foods GB/T 5009.33—1996 1 主题内容与适用范围 本标准规定了食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法。 本标准适用于食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定。亚硝酸酸盐方法检出限为1 mg/kg，硝酸盐方法检出限为1.4 mg/kg。 第一篇 格里斯试剂比色法（第一法） （一）亚硝酸盐测定 2 原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基
乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。 3 试剂 实验用水为蒸馏水，试剂不加说明者，均匀分析纯试剂。 3．1
氯化铵缓冲液：1 L容量瓶中加入500 mL水，准确加入20.0 mL盐酸，振荡混匀，准确加入50 mL氢氧化铵，用水稀释至刻度。必要时用稀盐酸和稀氢氧化铵调试至pH9.6～9.7。 3．2 硫酸锌溶液（0.42 mol/L）：称取120 g硫酸锌（ZnSO4·7H2O），用水溶解，并稀释至1 000 mL。 3．3
氢氧化钠溶液（20 g/L）：称取20 g氢氧化钠用水溶解，稀释至1 L。 3．4 对氨基苯磺酸溶液：称取10 g对氨基苯磺酸，溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。 3．5 N-1-萘基乙二胺溶液（1 g/L）：称取0.1 g N-1-萘基乙二胺，加60%乙酸溶解并稀释至100 mL，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。 3．6 显色剂：临用前将N-1-萘基乙二胺溶液（1 g/L）和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。 3．7
亚硝酸钠标准溶液：准确称取250.0 mg于硅胶干燥器中干燥24 h的亚硝酸钠，加水溶解移入500 mL容量瓶中，加100 mL氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光保存。此溶液每毫升相当于500 μg的亚硝酸钠。 3．8 亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0 μg亚硝酸钠。 4 仪器 4．1 小型粉碎机。 4．2 分光光度计。 5 操作方法 5．1 样品处理 称取约10.00 g（粮食取5 g）经绞碎混匀样品，置于打碎机中，加70 mL
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水和12 mL氢氧化钠溶液（20 g/L），混匀，用氢氧化钠溶液（20 g/L）调样品pH=8，定量转移至200 mL容量瓶中加10 mL硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2～5 mL氢氧化钠，混匀。置60℃水浴中加热10 min，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5 h，用滤纸过滤，弃去初滤液20 mL，收集滤液备用。 5．2 测定 5．2．1 亚硝酸盐
标准曲线的制备：吸取0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0.5.0 mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0,2.5,5,10,15,20,25 μg亚硝酸钠），分别置于25 mL带塞比色管中。于标准管中分别加入4.5 mL氯化铵缓冲液，加2.5 mL60%乙酸后立即加入5.0 mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25 min用1 cm比色杯（灵敏度低时可换2 cm比色杯），以零管调节零点，于波长550 nm处测
吸光度，绘制标准曲线。 低含量样品以制备低含量标准曲线计算，标准系列为：吸取0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0,2,4,6,8,10 μg亚硝酸钠）。 5．2．2 样品测定：吸取10.0 mL上述滤液（5.1）于25 mL带塞比色管中，自5.2.1“于标准管中分别加入4.5 mL氯化铵缓冲液”起依法操作。同时做试剂空白。 6 计算 1000100012121×××=VVmmX……………………………………（1） 式中：X1——样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg； m1——样品质量，g； m2——测定用样液中亚硝酸盐的质量，μg； V1——样品处理液总体积，mL； V2——测定用样液体积，mL。 结果的表述：报告算术均值的二位有效数。 7 允许差 相对相差≤10%。 （二） 硝酸盐测定 8 原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱，或加入镉粉，使其中的
硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。 9 试剂 9．1 氯化铵
缓冲溶液（pH9.6～9.7）：同3.1。 9．2 硫酸镉溶液（0.14 mol/L）：称取37 g硫酸镉（CdSO4·8H2O），用水溶解，定容至1 L。 9．3 盐酸溶液（0.1 mol/L）：吸取8.4 mL盐酸，用水稀释至1 L。
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9．4 硝酸钠标准溶液：准确称取500.0 mg于110～120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移于500 mL容量瓶中，加50 mL氯化铵缓冲液，用水稀释至刻度，混匀，在4℃冰箱中避光保存。此溶液每毫升相当于1 mg硝酸钠。 9．5 硝酸钠标准使用液：临用时吸取硝酸钠标准溶液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，临用时现配。此溶液每毫升相当于10 μg硝酸钠。 9．6 亚硝酸钠标准使用液同3.8。 9．7 镉柱（镉粉）。 9．7．1 海绵状镉粉的制备：于500 mL硫酸镉溶液中，投入足够的锌棒经3～4 h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾斜法多次洗涤，然后移入粉碎机中，加500 mL水，捣碎约2 s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取20～40目之间的部分，置试剂瓶中，用水封盖保存，备用。 9．7．2 镉柱还原效率的测定：取25 ml
酸式滴定管数支，向柱底压入1 cm高的
玻璃棉作垫，上置一小漏斗，将新配制的镉粉带水加入柱内，边装边轻轻敲击柱，排除柱内空气，加镉粉至8～10 cm高，上面用1 cm高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗。 当镉柱填装好后，先用25 mL盐酸（0.1 mol/L）洗涤，再以水洗两次，每次25 mL，调节柱流速至3～5 mL/min。镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。 镉柱每次使用完毕后，应先以25 mL盐酸（0.1 mol/L）洗涤，再以水洗两次，每次25 mL，最后用水覆盖镉柱。 柱先加25 mL氯化铵缓冲液，至液面接近海绵镉时，吸取2.0 mL硝酸钠标准使用液（10 μg/mL），经柱还原，控制流速3～5 mL/min，用50 mL容量瓶接收。加入5 mL氯化铵缓冲溶液，液面接近海绵镉时，加入15 mL水洗柱，还原液和洗液一并流入50 mL容量瓶中。加5 mL60%乙酸，10 mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，暗处放置25 min。用1 cm比色杯，以标准零管调节零点，于波长550 nm处测吸光度，根据亚硝酸盐标准曲线计算还原效率（如镉柱还原率小于95%，应经盐酸浸泡活化处理）。 9．7．3 镉粉还原效率的测定：镉粉使用前，经盐酸浸泡活化处理，再以水洗两次，用水浸没待用。用牛角勺将镉粉加入25 mL带塞刻度试管中，至5 mL刻度；用少量水封住。吸取2.0 mL硝酸钠标准使用液加入5 mL氯化铵缓冲液。盖上试管塞，振摇2 min，静止5 min，用漏斗颈部塞有少量脱脂棉的小漏斗过滤，滤液定量收集于50 mL容量瓶中，用15 mL水少量多次地洗涤镉粉，洗液与滤液合并。加5 mL乙酸（60%）后，立即加10 mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，暗处置25 min。用1 cm比色杯，以标准零管调节零点，于550 nm波长处测吸光度，根据亚硝酸盐标准曲线计算还原效率。 9．7．4 计算 10020232.132××=mX……………………………………（2） 式中：X2——还原效率，%； 20——硝酸盐的质量，μg； m3——20 μg硝酸盐还原后测得亚硝酸盐的质量，μg；
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1.232——亚硝酸盐换算成硝酸盐的系数。 10 分析步骤 10．1 样品处理 同5.1。 10．2 测定（用镉柱法或镉粉法还原硝酸盐为亚硝酸盐） 10．2．1 甲法（镉柱法）：经活化的镉柱先加25 mL氯化铵缓冲液，至液面接近海绵镉时，准确吸取5.1的样品滤液10.0 mL，加入镉柱还原。以下按9.7.2自“控制流速3～5 mL/min”起依法操作。 10．2．2 乙法（镉粉法）：准确吸取5.1的样品滤液10.0 mL，置于盛有高度5 mL镉粉的25 mL带塞刻度试管中。自“加入5 mL氯化铵缓冲液…”按9.7.3依法操作。 注：蔬菜、腌菜类食品中硝酸盐含量较高，可根据样品中硝酸盐的实际含量，将样品溶液稀释至适当浓度。 11 计算 1000)/(1000232.1)(344653××××−=VVmmmX……………………………………（3） 式中：X3——样品中硝酸盐的含量，mg/kg； m4——样品的质量，g； m5——经镉粉还原后测得亚硝酸钠的质量，μg； m6——直接测得亚硝酸盐的质量，μg； 1.232——亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数。 V3——样品处理液体积，mL； V4——测定用样液体积，mL。 结果的表述：报告
算术平均值的两位有效数。 12 允许差 相对相差≤10%。 第二篇 示波极谱法（亚硝酸盐测定）（第二法） 13 原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8-羟基喹啉偶合形成橙色染料，该偶氮染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐的浓度呈线性关系，可与标准曲线比较定量。 14 试剂 14．1
亚铁氰化钾溶液：称取106.0 g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]，用水溶解，并稀释至1 000 mL。 14．2
乙酸锌溶液：称取220.0 g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]，加30 mL冰乙酸溶于水，并稀释至1 000 mL。 14．3 饱和硼砂溶液：称取5.0 g硼酸钠（Na2B4O7·10H2O），溶于100 mL热水中，冷却后备用。 14．4 对氨基苯磺酸溶液（8 g/L）：称取2 g对氨基苯磺酸，用热水溶液，再加25 mL盐酸（1.0 mol/L），移至250 mL容量瓶稀释至刻度。
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14．5 8-羟基喹啉溶液（1 g/L）：称取0.250 g 8-羟基喹啉，加4 mL盐酸（0.1 mol/L）和少量水溶解，移至250 mL容量瓶稀释至刻度。 14．6 EDTA溶液（0.10 mol/L）：称取3.722 gEDTA（C10H14N2O8Na·2H2O）加水30 mL溶解，转入100 mL容量瓶中用水稀释至刻度。 14．7 氨水（5%）：吸取28%的浓氨水5.00 mL于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。 14．8 亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.100 0 g亚硝酸钠于硅胶干燥器中24 h，加水溶解移入500 mL容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于200 μg亚硝酸钠。 14．9 亚硝酸钠标准使用液：准确称取亚硝酸钠标准溶液5.00 mL于200 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5μg亚硝酸钠。再取10.00 mL该稀释液于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.5 μg的亚硝酸钠。 15 仪器 15．1 小型绞肉机。 15．2 JP-2A或JP-1A示波极谱仪。 16 操作方法 16．1 样品处理 称取5.000 g经绞碎混匀的样品（午餐肉，火腿肠可称10.00～20.00 g），置于50 mL烧杯中，加12.5 mL硼砂饱和液，搅拌均匀，以70℃的水300 mL将样品洗入500 mL容量瓶中，于沸水溶中加热15 min取出后冷却至室温，然后一面转动，一面加入5 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30 min，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液50 mL，滤液备用。 16．2 测定 吸取3 mL上述滤液于10 mL容量瓶（或比色管）中，另取0,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,3.00 mL亚硝酸钠标准溶液（相当于0,0.25,0.50,0.75,1.00,1.25,1.50 μg亚硝酸钠）于10 mL容量瓶（或比色管）中。于标准与样品管中分别加入0.20 mL EDTA溶液（0.10 mol/L），1.50 mL对氨基苯磺酸溶液（8 g/L），混匀，静止3～4 min后各加入1.00 mL8-羟基喹啉溶液（1 g/L）和0.5 mL氨水（5%），用水稀释至刻度，混匀，静止10～15 min，将试液全部转入电解池中（10 mL小烧杯）。在示波极谱仪上采用三电极体系进行测定（滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为铺助电极）。 测定参考条件： 原点电位调节在－0.2 V； 倍率为0.1（可以根据试样中亚硝酸盐含量多少选择合适的倍率，含量高，倍率高，倍率选择在0.1以上；反之，倍率选择在0.1以下）； 电极开头拔至三电极、导数档； 测量开关拔至阴极。 将三电极插入电解池中，每隔7 s仪器自行扫描一次，在荧光屏上记录－0.56 V左右（允许电位波动10～20 mV）的极谱波高，绘制标准曲线比较。 17 计算 10001000)/(100056784××××=VVmmX……………………………（4）
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式中：X4——样品中亚硝酸盐的含量，g/kg； m8——测定用样液中亚硝酸盐的质量，μg； V5——样品溶液的总体积，mL； V6——测定用样液的体积，mL； m7——样品质量，g。 结果表述：报告算术平均值二位有效数。 18 允许差 相对相差≤10%。 附加说明： 本标准由卫生部卫生监督司提出。 本标准第一法由卫生部食品卫生监督检验所、河南省食品卫生监督检验所、吉林省卫生防疫站、青岛医学院负责起草；第二法由华中师范大学、湖北省食品卫生监督检验所、武汉同济医学大学负责起草。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 中华人民共和国卫生部 1996—06—19 批准 1996—09—01 实施