细胞悬浮培养技术

Question

如题所述

Answer 1

植物细胞悬浮培养 实验方法
1.用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入三角瓶中并轻轻夹碎。每100ml三角瓶含灭过菌MS培养基10~15ml，每瓶接种1~1.5g愈伤组织，以保证最初培养物中有足够量的细胞。
2.将已接种的三角置于旋转式摇床上。在100r/min，25~28℃条件下，进行振荡培养。
3.经6~10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养瓶中加新鲜培养基10ml，必要时，可用大口移液管将培养物分装成两瓶，继续培养。（若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当，应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）。可进行第一次继代培养。
4.县浮培养物的过滤：按“3”法继代培养几代后，培养液中应主要由单细胞和小细胞团（不多于20个细胞）组成。若仍含有效大的细胞团，可用适当孔径的金属网筛过滤，再将过滤后的县浮细胞继续培养。
5.细胞计算。取一定体积的细胞县液，加入2倍体积的8%的三氧化铬（CrO3），置700C水浴处理15min。冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴县液置入血细胞计数板上计数。
6.制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：
（1）鲜重法（fresh weigh method）
在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮细胞培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
（2）干重法（dry weigh method ）
可在称量鲜重之后，将细胞进行曲烘干，再称量干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重生长曲线。
上述两种方法均需每隔2天取样一次，共取7次，每个样品重复三次，整个实验进行期间不再往培养瓶中换入新鲜培养液。
7.细胞活力的检查。对于初学者，往往需要检测活细胞的比率。可在培养的不同阶段，吸取一滴细胞县液，放在载玻片上，滴一滴0。1%的酚藏花红溶液（用培养基配制）染色，在显微镜下观察。几活细胞均不着色，而死细胞则很快被染成红色。也可用0。1%荧光双醋酸酯溶液染色，凡活细胞将在紫外光诱发下显示蓝绝色荧光，有经验的操作者，则可根据细胞形态，胞质环流判别细胞的死活。
8.细胞再生能力的鉴定：为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力，可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上，使基再形成愈伤组织，进而在分化培养基上，诱导植株的分化。