实验专栏 | 大肠杆菌原核表达的整体思路

Question

如题所述

Answer 1

原核表达整体思路的介绍

在探索生命现象的过程中，蛋白质的结构与功能成为了现代生物学研究的核心。为了深入理解生命过程，研究蛋白质的表达与功能成为了生物学家们的重要任务。而大肠杆菌原核表达系统因其操作简单、成本低廉且表达量高，成为了蛋白质表达领域的首选方法。下面，我们将对大肠杆菌原核表达的整体思路进行简要介绍。

原核表达的整体思路主要包括以下几个步骤：

第一步：确定表达策略

在进行表达之前，首要任务是确定合适的表达策略。这涉及到三个关键方面：目的基因来源、载体选择以及菌株选择。

首先，目的基因的来源决定了后续步骤的执行。基因可以从NCBI数据库中获得，随后需要对基因序列和来源物种进行分析，以便了解其密码子偏好性和蛋白质的定位。然后，根据基因的性质选择合适的载体，如pET系列、pMAL系列或pGEX系列等，这些载体各有特点，适合不同类型的蛋白质表达。此外，还需要考虑载体的表达调控元件、拷贝数以及是否带有易于纯化的标签，如6His、MBP等。

第二步：获得目的基因

目的基因来源物种的获取方式多种多样。如果物种容易获得，可以提取基因组或总RNA进行PCR或RT-PCR扩增。当物种难以获取时，可以通过优化目的基因序列后进行合成。

具体而言，通过PCR方法，使用含目的基因的克隆质粒作为模板，设计一对引物，分别包含不同的酶切位点，以实现基因片段的扩增。而通过RT-PCR方法，首先从细胞或组织中提取总RNA，通过逆转录形成cDNA第一链，然后以此为模板进行PCR循环。

第三步：构建重组表达载体

构建载体通常采用酶切/酶连的方法。现在市场上有很多公司提供了重组试剂盒，使得构建载体变得更为简便且成本逐渐降低。构建载体的基本流程包括载体酶切、PCR产物的双酶切回收、连接入载体以及后续的转化、筛选和测序。

首先，载体需用限制性内切酶进行双酶切，随后通过琼脂糖电泳进行回收。接着，将PCR产物进行双酶切回收，再在T4-DNA连接酶的作用下连接入载体。完成连接后，下一步是进行转化、筛选和测序，以确保构建的载体正确无误。

第四步：转化表达菌株与小量表达

通过测序验证后，将构建的载体转入表达菌株中。接着，挑取几个单克隆进行小量表达，通过SDS-PAGE或Western Blot方法分析表达情况。在此基础上，优化表达条件，包括诱导时机、诱导剂的量、诱导时间以及培养温度等，以获得最佳的表达效果。

如果实验出现不表达的情况，需仔细分析问题所在，如蛋白毒性或本底表达等，并相应调整表达策略。

第五步：大量表达

经过小量表达的优化后，根据所需蛋白量，按照优化的条件进行大量表达。确保实验的重复性，严格进行放大操作。收集菌体后，使用预冷的PBS清洗，若不立即纯化，建议进行液氮冷冻后保存于-80℃。

在整个过程中，大肠杆菌原核表达系统为蛋白质表达提供了便利，但实际操作中仍需细心关注每个环节，确保实验的顺利进行。希望本文能够为研究者们提供有益的参考和指导。