转录组数据分析RNA-seq

Question

如题所述

Answer 1

RNA-seq（RNA测序）是一种先进的转录组研究技术，它利用高通量测序平台来直接测量细胞中的RNA分子数量。这种技术能够提供关于基因表达的定量信息，包括未知基因的发现、已知基因的表达水平变化、以及可变剪接事件等。RNA-seq数据分析是一个复杂的过程，主要分为以下步骤：
1.数据质量控制：
检查原始测序数据的质量，去除低质量的读段（reads）。
2.序列比对：
将质量控制后的读段与参考基因组或转录本数据库比对，以确定它们的位置。
3.定量分析：
统计每个基因的读段数，通常表达为FPKM（每千个碱基的片段数每百万映射读数）或TPM（每百万转录本的片段数）等标准化指标，以消除基因长度和测序深度的影响。
4.差异表达分析：
使用统计模型比较不同条件或组别之间的基因表达水平，确定差异表达基因。
5.生物学功能解释：
对差异表达基因进行富集分析，包括基因本体（GO）分析和通路分析（如KEGG），以揭示这些基因在生物学上的作用。

Answer 2

转录组学（transcriptomics）的研究对象是全基因组尺度下所有转录本（transcript），即转录组（transcriptome）

将荧光标记的cDNA制成微阵列探针来测定样本中特定转录本含量。又称为 基因芯片（Gene Chip）、微阵列（Microarry）。

获取表达量的步骤：
提取RNA -> 反转录 （->扩增）->标记->杂交->扫描->获得原始数据
局限性：
• 只能检测已知或；确定性的序列
• 无法检测新发现的，未放置到芯片上的基因
• 有部分探针的信号可能会收到非特异性杂交或个体序列差异的影响

基于高通量二代测序技术的转录组学研究方法。
特点：
高通量、低成本；不依赖已知转录本探针，可以测全转录组；对于低表达丰度的转录本灵敏
度高；以reads数量腐酸表达，比芯片的荧光信号更为精确。
应用和最新进展

依据文库要求检查完整性分值，如果不合格将不适合建库测序。一些特殊文库对RNA提取要求很高，如全长转录组文库，需要特殊提取流
程保证RNA 完整性。

需要的数据：参考基因组数据fasta、GFF注释信息、双端测序的fastq文件
我这里用的是普通栽培稻( Oryza sativa L.)的参考基因组和、GFF文件和SRR17439319数据。
参考步骤： https://blog.csdn.net/sunchengquan/article/details/79781366
注意：配置时，需要在bin目录下执行 ./vdb-config --interactive ，然后弹出一大堆乱七八糟的之后，按X退出即可。再执行./fastq-dump，若没有报错，而是帮助信息的话即可以使用。

测序数据分析前需要经过数据预处理，并检查数据GC含量、序列重复成俗、是否存在接头等。

在质控后，再质检一次，对比看看有什么不同。

将 reads 匹配到参考基因组或转录组的相应位置上
• 非剪接比对：转录组
Bowtie、BWA
• 剪接比对：参考基因组
STAR、HISAT、Topha
对鉴定SNP做了优化： GSNAP、MapSplice等

① 建立基因组索引

②利用注释文件比对

没有注释文件的比对方法

③ SAM 文件处理
使用 samtools 对 SAM 文件排序并转化为 BAM 文件。samtools是一个用于操作sam和bam文件的工具合集，包含有许多命令。

④比对结果可视化
比对结果使用 IGV 、Genome Maps 和Sacant 等可视化查看。
例如：IGV 通过读入基因组和注释信息以及BAM 文件展示比对结果。
需要额外添加 BMA 的索引: samtools index test_sorted.bam test_sorted.bai

⑤比对结果评估
比对结果评估工具：RSeQC、Qualimap

计算FPKM

-p 线程数
-G 参考基因组注释
-e 只估计已给参考基因组注释的基因丰度
-A 基因丰度估计输出文件
-o 输出文件