含有20ug/ml的蛋白酶K，对细菌基因组DNA的PCR反应有影响吗

Question

25ul的PCR体系中，含有20ug/ml的蛋白酶K，对细菌基因组DNA的PCR反应有影响吗？纯化后的蛋白酶K没有DNA酶活性，但它会消化PCR体系中的Taq酶吗？
不怕假阳性。
就怕假阴性

Answer 1

会的。酶促反应很快，何况蛋白酶k的最适温度是55度。这样的话 从你加入Taq开始 蛋白酶k就从室温开始作用了，直到70度以上失去活性而停止，有无Taq残留 要看你加样后多长时间上机的。

电泳图分析：我个人认为你的所谓的“好带”（1-2泳道）不见得是理想的。因为你根本没有提取到基因组DNA,从分子量判段 只是一个小的质粒，很纯，很好。
基因组DNA特点：因为大，所以在提取中常常会有降解造成拖带。此外基因组很大，一般不用电泳方法判断。你的结果中，5、8、4、6 按顺序都可看到基因组DNA(最上边的——其实是smear 很宽的)。 1-2泳道基因组DNA也有 但不如5、8 道。5道中的小分子 可能是RNA.
在56°水浴2h后(蛋白酶k工作)，大多有“ 95°水浴10-15分钟”一步（灭活蛋白酶k），这一不应该是要的。

Answer 2

蛋白酶K的活性还是很强的，需要85度1小时灭活。
如果不灭活直接做PCR，聚合酶活性会被蛋白酶K所抑制。

建议你做PCR之前将含蛋白酶K的DNA模板于水浴85度灭活1小时。这是我们实验室摄取基因组DNA的方法。有时候实验忙，我水浴过2小时3小时，PCR都没有问题。此过程DNA模板可能会有些降解，但对于做一般几百bp一两kB的PCR没什么影响。

有一两次我忘了85度灭活，PCR就P不出来任何东西，说明蛋白酶K的灭活是需要一定时间的，想依靠PCR刚开始那几分钟的95度高温是冒险的。本回答被提问者采纳

Answer 3

模版裂解不会影响你的pcr，但是你的蛋白酶k会影响你的pcr，因为在你加入dna聚合酶后，在放在pcr仪上之前就会被蛋白酶k降解，你说有没有影响。的确在pcr反应的第一步蛋白酶k就被灭活了，但是你的聚合酶在这之前就over了。

Answer 4

虽然蛋白酶K的到了65℃以上就迅速变性，而且PCR第一步94℃预变性的时候就足以破蛋白酶K的活性。但问题是你加模板直到PCR仪升温到蛋白酶变性这段时间Taq暴露在有活性的蛋白酶K之下，咋办？

哥教你个更省力的方法，菌体离心除去培养基，无菌水漩涡振荡悬浮，丢进沸水浴中煮半小时，完了迅速丢进-20℃冰箱，冰冻后拿出来化冻，离心机甩一下，沉淀掉菌体碎片，取上清就作为模板进行PCR。

你不就是做个PCR么？根本不用跑什么DNA模板的电泳，模板质量那么高干嘛？你想想为啥PCR怕污染，假阳性？就是因为它比较灵敏，灵敏的东西你何必给他高质量的模板？降解就降解了，你的那一小段基因总有点保留下来的。
上面这种耗时不到一小时的方法做的模板我从来没跑出模板DNA条带，但是跑16s rDNA（1.5kbps）的PCR就是能跑出来。

Answer 5

如果要用蛋白酶的话最好还是先灭活。
首先看你实验的细菌是阴性菌还是阳性菌。
阴性菌：从培养皿上直接挑单菌落活化，按1：100重新培养，在对数生长期前取出，低速离心，取细胞用去离子水洗2次，加入离心前菌液体积5倍的水稀释混匀，直接用作PCR模板，这样可以保证基因组DNA的完整，一般情况可以扩增出想要的片段。
阳性菌：只能按照传统的碱裂解法或者高盐法等方法提取了DNA再PCR。