求分子克隆具体实验步骤一份~~多谢各位大侠啦~

Question

不要书上那种好多方法的，要实际做过的按照每一步先做什么后做什么的顺序~~越详细越好哦~多谢啦~~

Answer 1

分子克隆实验流程
第一天
一:目的片段的扩增（PCR）
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。
1.PCR(50ul)
ddH2O 37.5ul
10x buffer 5ul
MgCl2（25mmol） 3ul
dNTP （10mmol） 1ul
primer 1（10mmol） 1ul
primer 2（10mmol） 1ul
cDNA 1ul
Taq 0.5ul
PCR反应条件：
94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者
94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温
注意：当所要扩增的目的片段较大时需要适当的增加延伸时间（一般产物越长，需要的时间越长：　1分钟/1kb）
2.琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入EB混匀倒板。其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml）
注：琼脂糖凝胶电泳检测如果有杂带侧需要割胶回收目的片段。
3.PCR产物纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用45ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
4.PCR产物酶切（50ul）
PCR纯化产物 43ul
10xBuffer Tango 5ul
E1 1ul
E2 1ul
酶切反应条件：37℃反应过夜或者37℃反应3-4h。
. PCR产物酶切纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用25-30ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
琼脂糖凝胶电泳检测：取2-5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。以确保回收到目的片段。

二．载体的制备
1．质粒DNA的制备：用柱式质粒DNA小量试剂盒抽提我们所要的载体质粒。
2.载体酶切（100ul）
质粒DNA 2ug
10xBuffer Tango 10ul
E1 2ul
E2 2ul
ddH2O 补足至100ul
反应条件：一般pGEX-4T 37℃水浴3-4h，pET系列37℃水浴过夜。
3. 琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，同时取200ng左右没有酶切的质粒做对照，保存电泳图片。（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入EB混匀倒板。其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml）
4.酶切产物纯化：根据PCR产物回收试剂盒上流程回收酶切产物,最后用20-30ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.

第二天

三．外源DNA片段在质粒载体中的克隆
1.外源DNA片段与质粒载体的连接（10ul）
DNA片段 6ul
载体 2ul
T4 DNA Ligase 1ul
Buf T4 DNA Ligase 1ul
反应条件：22℃水浴3-4h或者16℃或4℃水浴过夜。
一般目的片段：载体摩尔比约为3:1，但是在这里我们通常是按体积比。
2.连接产物转化
取全部连接产物加入到不少于5-7倍体积感受态细胞溶液中，冰浴20min，42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h。4000rmp离心1min弃上清同时保留100-200ul混匀菌体沉淀后均匀涂布抗性平板上。37℃恒温箱培养过夜。
质粒转化
取质粒1ul或50-100ng加入50-70ul所需的感受态细胞溶液中，冰浴20min，42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h。取100-200ul菌体均匀涂布抗性平板上。37℃恒温箱培养过夜。
注：1一定要区分质粒和连接产物转化的不同，不要理所当然。
2根据实验要求选择所需要的感受态。
3在选择抗性平板的时候要根据所选载体和感受态两个方面确定。

第三天

收集涂布的抗性平板检查菌落生长情况4℃保存待下一步实验;筛选鉴定或酶切鉴定

筛选鉴定
菌落 PCR(25ul)
ddH2O 19.2ul
10x buffer 2.5ul
MgCl2（25mmol） 1.5ul
dNTP （10mmol） 0.5ul
primer 1（10mmol） 0.5ul
primer 2（10mmol） 0.5ul
Taq 0.3ul
模板为单菌落
PCR反应条件：
94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者
94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温
注：1一般一个项目要挑选5个单菌落做菌落PCR
2在以菌落为模板时要事先准备相应抗性平板，用枪头挑选菌落时要先在事先准备的相应平板上划线标记好顺序再将枪头放入上述反应体系中搅匀一下。
3该PCR 的primer 为通用primer 所以在原来目的片段的大小上加上100-200bp。
琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。根据大小判断该菌落是否正确。下班前挑取（在划线的板子上）筛选正确的菌体接种到5ml 含相应抗性的LB培养基37℃ 200rmp培养过夜。

Answer 2

16S rDNA方法鉴定细菌种属
一．目的
1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；
2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、原理
随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。　
在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。
　　2、在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
　　3、16S rRNA 的相对分子量大小适中，约1 540 个核苷酸，便于序列分析。
4、可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。
利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：
细菌培养液
基因组DNA
DNA提取
PCR扩增
16S rDNA片段
片段回收
连接克隆载体
阳性克隆鉴定
测 序

序列比对

三、操作步骤
（一）细菌基因组DNA提取
1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3. 加140 μLTE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。37℃放置10分钟。
4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。
5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。
9. 加入50 μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。
10. 电泳。取3 μL溶液电泳检测质量。

（二）PCR扩增
1. 根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物。
16S (F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2. PCR扩增体系：
在0.2 mL Eppendorf管中加入1μL DNA，再加入以下反应混合液：
16S (F) 1μL (10μM)
16S (R) 1μL (10μM)
10×PCR Buffer 5 μL
dNTP 4 μL
Taq酶 0.5 μL
加ddH2O使反应体系调至50 μL，简单离心混匀。
3. PCR反应
将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为：
94℃ 3 min
94℃ 30 sec
50℃ 45 sec 35 cycles
72℃ 100 sec
72℃ 7 min
4. PCR产物的电泳检测
拿出Eppendorf管，从中取出5 μL反应产物，加入1μL上样缓冲液，再加入4ul的ddH2O混匀。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳1 hr。在紫外灯下检测扩增结果。

（三）扩增片段的回收
根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。
1）称量一2 mL.的Eppendorf管质量，记录。
2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的Eppendorf管内，称量。计算凝胶质量。
3）每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。60℃温育至凝胶融化。
4）全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
5）加入500 μL Binding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6）加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7）再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。
8）加入30 μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。

（四）DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。