基因是一切生命活动的源头，只要找到目标基因，就能针对性地开展这个基因的功能、机制，以及后续的表达等一系列研究。自从沃森和克里克提出DNA双螺旋结构开始，人类自此开始破译生命密码。
基因编辑是一种对靶基因或转录产物进行敲除、插入和定点突变等精确修饰的基因工程技术，主要通过人工核酸酶实现对基因组的特定基因序列的敲除、插入或精确修饰。基因编辑能够高效率地进行定点基因组编辑，故而在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的应用前景。
目前，主要有三大基因编辑技术，包括：锌指核酸酶技术，转录激活效应因子核酸酶（TALEN）技术和CRISPR/Cas9技术。点击图片可详细了解☟
今天我们要谈的便是目前最前沿、最有效的基因组编辑方法——CRISPR/Cas9。我们将简单阐述CRISPR/Cas9技术的理论背景和主要应用，希望能对大家的研究有所启发。
（一）CRISPR系统介绍
CRISPR是“成簇规律间隔短回文重复序列”(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的缩写，原核生物（细菌和古生菌）利用它来防止噬菌体病毒的感染。其原理核心是使原核生物能够识别与噬菌体或其他入侵者相匹配的基因序列，并利用专门的酶将这些序列作为破坏目标，这些专门的酶称为CRISPR相关蛋白Cas（CRISPR associated proteins）。
根据CRISPR/Cas系统的特性，科学家将其改造成了目前最高效的基因组编辑工具。目前，来自Streptococcus pyogenes（酿脓链球菌）的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成：SpCas9 (以下简称Cas9)、crRNA、tracrRNA。其中，crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组成gRNA(guide RNA)，gRNA与Cas9蛋白结合后引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA序列。
为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier（2020年她们共同获得了诺贝尔化学奖）将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA，并把其称为sgRNA (single-guide RNA)。改造后的CRISPR/Cas9系统成为研究者做基因编辑的首选工具。
（二）CRISPR/Cas9技术原理
CRISPR-Cas9技术包含两种重要的组分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的gRNA。CRISPR-Cas9的技术原理包括gRNA引导的Cas9靶向DNA切割和DNA修复两个基本过程。
首先，Cas9蛋白特异性切割目标DNA序列，产生DNA双链断裂。
Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9蛋白要成功识别目标序列必须满足两个条件：(1)gRNA的5'端20 nt和靶DNA之间碱基配对；(2) 靶DNA的3'端有合适的PAM序列（PAM是cas9的特异性识别位点，cas9会在PAM上游的第三个碱基处进行切割）。
CRISPR/Cas9切割目标DNA后，产生双链断裂（DSB, double strand break），DSB是一切基于核酸内切酶的基因编辑的基础。
然后，细胞内的DNA修复系统修复双链断裂，在修复的过程中实现DNA序列的改变。
DNA修复机制分为两类：非同源性末端接合（Non-homologous end joining, NHEJ）和同源介导的修复（Homology-directed repair, HDR）。
那什么是非同源性末端接合？什么是同源介导的修复呢？
非同源性末端接合就是通过DNA连接酶将双链断裂末端直接连接的一种修复过程，不依赖于同源DNA序列。这种连接过程简单粗暴，虽然迅速高效，但是会随机造成一些序列的缺失或插入，导致无法精准编辑。非同源性末端接合是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。
同源介导的修复则是以未受伤的姐妹染色单体的同源序列作为其修复的模板。虽然同源介导的修复速度较慢，效率较低，但是非常精准，可以使基因组修复到完美如初。如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
综上，CRISPR技术主要是利用位点特异Cas核酸酶在基因组靶位点处引入DNA双链断裂，再经细胞自身的非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组修复(HDR)对双链断裂进行修复，最终实现目标基因敲除和碱基编辑等基因组遗传修饰。可以看出gRNA 和 Cas9是基因组编辑成功的两个关键因素。
CRISPR/Cas9之所以颠覆了以往的基因编辑技术，就是因为只需要改变单链向导RNA（sgRNA）的5'端序列即可重编程Cas9的序列特异性，再加上，CRISPR/Cas9合成简单、周期短、操作简单、效率高，因此也就成为了目前研究最多、应用最广泛的基因编辑工具。
（三）在疾病研究和治疗中的应用
CRISPR-Cas9作为新一代的基因编辑技术，在基因功能研究、模式动物构建、基因治疗等方面具有广阔的应用前景。目前，CRISPR-Cas9技术已广泛应用于生命科学研究的诸多领域，并且已用于地中海贫血症临床治疗试验，基因编辑技术将继续对生命科学研究、基因治疗、生物产业、伦理等产生广泛而深刻的影响。
① 筛选目标基因
CRISPR-Cas9系统最初和最常用的功能就是目标基因的敲除，随着不断改进之后现在可以实现对目标基因进行过表达。CRISPR系统可批量地敲除或过表达某些基因，因此可用作筛选目标基因，再配合相应的功能实验，即可找出该生命活动或疾病中的关键目标基因。
CRISPR/Cas9 作为一种高效且广泛应用的基因编辑方法，迅速成为研究的热点。目前CRISPR系统主要应用在下面四个方面研究：
1. 基因通路调控机制研究
2. 药物靶点及抗药性机制研究
3. Gain-of-Function鉴定关键基因及相关研究
4. 结合其他技术对特定细胞基因及功能研究
近年来，越来越多的文章利用CRISPR/Cas9技术在多种生命活动、疾病模型中筛选出新的关键基因。目前这一类型的文章套路（逻辑和思路），几乎就是以下四个部分：1）筛选模型构建；2）关键基因粗筛和聚集；3）关键基因相关基因通路研究；4）关键基因及其相关基因通路模式提出。其中找到关键目标基因，不管是机制研究，还是应用型研究，都是非常重要的第一步，且极具原创性，是通往高分文章的一条捷径。
② 模式动物构建
动物疾病模型可以模拟人类疾病的生物学和病理特征，在疾病发生机理和药物筛选等基础和转化研究中发挥关键作用。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠、大鼠、猪、灵长类、果蝇等等。CRISPR/Cas9 技术因具有编辑效率高、操作简单和适用范围广等优点，已广泛用于肿瘤、神经退行性疾病、白化病等疾病模型的建立。
③ 疾病治疗
RISPR/Cas9的出现为人类基因编辑提供了新的可能性，不仅可用于表达调控和基因功能的研究、细胞动物模型的构建、癌基因和药物靶点的筛选，在基因治疗中更是具有巨大的发展前景，为多种疾病提供了新的治疗方法。
基因治疗通过导入正常基因或者编辑修复缺陷基因，实现治疗疾病的目的。目前，CRISPR基因编辑技术已在多种疾病，如单基因遗传病、眼科疾病、艾滋病及肿瘤等的基因治疗中得到了应用。
去年1月份，一篇题为What’s new in clinical CRISPR?的新闻稿发表在Nature Medicine上。文章中提到已经有治疗β-地中海贫血、镰状细胞病和治疗眼部疾病的CRISPR应用到临床试验中。
并且文章还指出使用CRISPR/Cas9技术改造得到的T细胞已经应用于癌症免疫治疗。
基因编辑应用于肿瘤治疗主要是与免疫治疗相结合，尤其是与CAR-T细胞，该方法在白血病、淋巴瘤和部分实体瘤中有巨大的发展前景。
利用CRISPR/Cas9系统同时破坏多个基因位点，产生的TCR（T cell receptor）和HLA-I（HLA class I）缺陷的CAR-T细胞可以减少移植物抗宿主病和免疫排斥反应的发生，在开发通用型CAR-T细胞中已被广泛应用。
除了产生通用的CAR-T细胞，CRISPR-Cas9技术也可以通过敲除编码信号分子的基因如PD1和CTLA4或编码T细胞抑制性受体的基因来提高CAR-T细胞的功能。
尽管CRISPR-Cas9基因编辑技术已经产生了革命性影响，但是在基因治疗领域的应用还需要更加谨慎，目前精确基因编辑仍然难以实现。
结语
CRISPR 技术在疾病治疗、基因功能调控、药物研发等多个方面具有广阔的应用前景，但仍存在一些问题限制其在实际环境中的应用。例如：脱靶效应、自身免疫带来的安全问题，PAM序列的限制等。
不过随着近几年的发展，CRISPR/Cas9技术不断完善，相比之前，无论是编辑效率还是避免脱靶效应都有了明显的改善，特别是在临床上的应用，有望解决一些以前没有治疗药物的疾病或者一些基因缺陷型疾病。
参考来源：
[1] A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. doi.org/10.1126/science...
[2]. Nobel Prize 2020 in Chemistry honors CRISPR: a tool for rewriting the code of life.
[3]. CRISPR/Cas9系统在疾病研究和治疗中的应用
[4]. What's new in clinical CRISPR?
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