流式细胞术的作用原理

Question

如题所述

Answer 1

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点。

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷流式细胞术酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。

细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

Answer 2

利用流式细胞术快速精确的对单个细胞的理化性质进行定量分析和分选，主要通过几个步骤：制备单细胞悬液，用特异性荧光染料标记的抗体进行染色，经染色后的待测细胞在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下细胞呈单行排列，依次通过检测区域，在激光束的照射下细胞会产生散射光和激发荧光。这两种信号会同时被光电倍增管( PMT) 接收。接收后可转换为电信号，通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，进行分析。

流式细胞术实验流程

单细胞悬液的制备：流式细胞术检测的对象一般是细胞，并且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞。如果要检测组织中的细胞，须先将组织制备成单细胞悬液。如果该培养细胞是贴壁细胞，需用胰酶消化处理；如果是胸腺、脾脏和淋巴结等外周免疫器官，直接将脏器用研磨制成单细胞悬液；如果是实体脏器（如肺脏、肝脏和肿瘤组），细胞之间结合较紧密，将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶进行细胞消化后再进行研磨。

荧光标记与上样：细胞悬液制成后，用特异性荧光标记的抗体与细胞上的抗原结合以达到对细胞荧光标记（染色）。在恒定气体的压力下进入流动室，不含细胞或微粒的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流形成一定角度，鞘液包绕着样品高速流动，组成一个圆柱形的液流束，待测细胞或微粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

激光照射及荧光信号收集：流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦的光束垂直照射在样品流上，细胞上的荧光染料被激发，产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

数据处理分析：荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度，光信号转换为可被计算机识别的电信号。计算机把所测量的各种信号进行处理分析。内容引自流式细胞术

Answer 3

流式细胞术的作用原理：待测样品(如细胞、微球、精子或细菌等)被制成单细胞悬液，在一定压力下被鞘液包裹着形成单列的细胞进入流动室，并与激光束相交。细胞被激光激发后产生散射光和荧光，经光电转换器处理后变为电信号，在电脑上以数字信号的形式展现出来。