转染实验注意事项（上）

Question

如题所述

Answer 1

转染实验注意事项：

保证无RNA酶环境进行实验

环境和空气中含有大量的RNA酶，痕量的RNA酶即可对RRNA造成严重的降解。必须使用DEPC水或RNase-free水对RNA产品进行稀释。实验过程中，需避免RNA产品与人体皮肤或未经去RNA酶的实验耗材接触。因呼吸产生的气体和飞沫中均含有大量的RNA酶，所以必须佩戴口罩于超净工作台内进行实验操作。

2. 转染条件优化

优化转染条件非常重要，不同的细胞和实验中，建议都进行最佳siRNA浓度和转染试剂浓度优化。若转染试剂的转染效率不佳，可以尝试更换其他转染试剂，不同的转染试剂操作可能会有很大差异，必须严格按照说明书进行实验。有条件的话可以更换效率更高的转染方法，如电转或病毒转染。

3. 使用多条siRNA验证表型

建议使用两条或以上的siRNA来验证表型，用于排除非靶向效应导致的假阳性结果。现在越来越多期刊也倾向于要求使用多条siRNA验证表型。

4. 使用无抗培养基

转染6~8 h内，要使用无抗培养基。因为抗生素对细胞有毒性，会影响siRNA的递送效果。

5. 保证健康的细胞状态

使用传代50代内的细胞进行实验，传代太多的细胞转染效率会下降。转染前必须保证细胞处于健康的状态，状态不佳的细胞其转染效率通常也很低，且对干扰效率的检测也有很大的影响。

6. 阴性对照、阳性对照和荧光对照

使用乱序siRNA作为阴性对照，可以排除非靶向效应对实验数据的干扰。使用阳性对照（我司赠送GAPDH siRNA）可对实验流程进行质检，帮助快速分析实验中可能存在的问题。使用荧光对照可分析siRNA的转染效率，方便进行最佳实验条件摸索。

Answer 2

如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或 2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。

用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。

培养基中的血清

在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。其实，只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。

培养基中的抗生素

抗生素是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。这时候可以选择 英格恩生物的Entranster转染试剂 ， 非脂质体试剂，培养基可加抗生素，避免了细胞染菌 。

设置阳性对照和阴性对照。

一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。

如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。

启动子的选择

启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。

质粒的大小和质量

线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。纯化质粒的质量也会影响转染效率，一定要选择高质量的质粒。

质粒DNA的浓度和量

既然质粒纯化已经不成问题，初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA，但是要注意的是，DNA量过少固然转染效率不高，DNA量过多同样会降低转染效率。所以预实验需要按照说明书的要求，按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。有的转染试剂要求DNA的量多些，有的转染试剂效率高只要很少DNA。

转染试剂的选择

在确定了质粒的质量之后，就要考虑转染试剂的选择了。目前大多数用的是脂质体类的转染试剂，但这类试剂的毒性较大，转染效率低，最好 选择非脂质体的转染试剂 ，如Entranster试剂 。

优化条件：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外， 可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂 。

抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

细胞状态及融合度：长势旺盛的细胞转染效果更佳，细胞密度应该在转染时融合度至少70%以上。

DNA纯度及数量：确保质粒OD值A260/A280在1.8~2.0之间。DNA量不能太高，单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响。