PCR无法P出目的条带

Question

最近在做PCR，提取的基因组为模板，基因组序列上从NCBI上找的，没有错。但是无论如何换引物和PCR条件，都会得到一条比目的片段大500bp左右的亮条带。（引物换了很多对儿，卡的应该没有问题）这会不会是因为用于提取基因组的菌种曾经被噬菌体感染，然后刚好在目的片段被插入了一段500bp的小片段呢？？？？？？求助！

Answer 1

菌落PCR的假阳性高很可能是因为你做PCR的循环数过大，我们实验室一般对于高拷贝数的质粒，循环数不会超过25个，一般用25个。假阳性出现的原因关键在于做连接的时候加了比较多的目的基因的酶切产物，在转化时，那些没有连接入载体的PCR产物，有的会沾在感受态细胞上，还有的虽然在溶液中，涂板时一起就一起涂在板上了，挑菌的时候可能会挑到，即使没挑到，但菌表面的基因片段也有可能被扩增，如果你的循环数太高，就会在PCR时呈现阳性结果。希望能帮到你追问

模板不是连接载体和转化菌体，是提取的Wild Type菌染色体DNA，只是获取目的片段那步

Answer 2

看一下延伸时间是不是改变了。这种情况可能是引物的问题应该是引物没有设计好，易形成二聚体或者发卡结构引起的。