第1个回答 2010-12-01
脑利钠肽检测方法及其在心血管疾病中的应用进展
南京医科大学检验系 童华诚（综述）潘世扬（审校）
关健词: 脑利钠肽（BNP）,心力衰竭（HF）, 左心室功能不全(LVD) 1981年de Bold 等从鼠的心房组织中发现了一种具有利尿、利钠、扩张血管作用的物质，并于1984年鉴定出这种由心房肌细胞分泌的多肽激素物质,命名为心房利钠肽（ANP），又称心钠素[1]。1988年科学家从猪脑组织中提取出脑利钠肽（Brain Natriuretic Peptide, BNP）。但随后的研究发现，这种多肽物质主要来源于心室肌组织，其分子结构与28个氨基酸构成的ANP相似，均包含一个17氨基酸组成并通过两个半胱氨酸之间的二硫键连接成的环状多肽结构[2]。此外，人体第三类利钠肽即C型利钠肽是血管内皮细胞分泌释放的激素，其确切功能尚待进一步研究，但有血管扩张特点[3]。
BNP由于其生物学特征及重要的临床应用价值，近年来受到广泛关注。现将其生物学特性、检测方法及其在心血管疾病诊断、治疗中的应用进展综述如下。
1. BNP生物学特性
脑利钠肽又称B-型利钠肽（B-type Natriuretic Peptide, BNP）是主要由心室肌细胞分泌的心脏激素,为32氨基酸组成的多肽片段，其氨基酸序列在不同物种间呈现高度保守性[2]。
人ANP和BNP基因定位1号染色体短臂远端，心肌细胞内这两种基因表达受锌指结构序列组件GATA4和GATA6调控。BNP反转录脱氧核糖核酸（cDNA）由1900个核苷酸组成，含有3个外显子和2个内含子。在5，端和3，端各含一个488bp和247bp的非编码区，其中5，端侧翼含2个“GATAAA”盒，3，端终止密码后70bp-100bp处有3个“TATTTAT”重复序列。心房、心室肌细胞均有BNP基因表达，而心室肌细胞ANP基因表达，在出生后几周内迅速下调，因此，成人心脏ANP的分泌是具有心房特异性的[1，2]。心房肌细胞合成ANP后储存于细胞内，受刺激后以一种囊泡介导的主动分泌方式释放至细胞外液中.ANP主要对细胞外液容量的变化作出快速反应。ANP合成后储存于心房肌细胞内，对刺激作出反应时，主要从储存池中释放出来，仅有少部分来源于新合成的激素。所以，ANP释放的调控主要在激素分泌水平并且ANP储存量往往在ANP mRNA转录激活前急剧减少。与ANP不同，BNP合成和分泌的调节主要在基因表达水平上进行。尽管BNP也可见存在于某些心房和心室肌细胞分泌颗粒中，但BNPmRNA转录速度要快得多。BNP基因包含不稳定的“TATTTAT” 核苷酸序列，提示BNPmRNA表达活性高，BNP合成、分泌呈爆发式。在心肌细胞内首先合成其激素原前体，经裂解去除一个26氨基酸的信号肽，以含108氨基酸的激素前体pre-proBNP形式分泌至细胞内，但pre-ProBNP在何处裂解为活性形式BNP-32（77～108位氨基酸）及其氨基端片段NT-ProBNP（1～76）至今尚未完全清楚。BNP在循环血液中的生物半衰期约为23分钟。BNP似乎不像ANP一样在心肌细胞有一定程度的储存，因此，BNP释放增加意味着合成加速。病理状态下BNP主要来源于心室肌细胞,左心室收缩强度增加或容量负荷压力增大是BNP生成和释放的主要调节因素[4，5]。
人体组织中广泛分布着三种不同的利钠肽类激素受体，分别为NPR-A、NPR-B和NPR-C，均为跨膜受体。其中NPR-A在大血管内皮细胞中最为丰富，对ANP亲和力最强，是其对BNP亲和力的10倍。NPR-B主要分布在大脑，也见于血管平滑肌组织，对CNP亲和力最强。ANP或BNP与相应受体结合后导致细胞内cGMP生成增加。cGMP作为第二信使，促进相关蛋白激酶、磷酸二酯酶和离子通道的激活，从而激发相应的生物活性作用。关于BNP增长抑制效应的信号特导性传导通道还未完全阐明，可能与某些有丝分裂原激活蛋白激酶的信号级联反应机制有关。NPR-C是体内含量最丰富的一类受体，主要分布于肾和血管组织，NPR-C是一类起清除作用的受体，当BNP与NPR-C结合后，通过受体介导的吞噬作用，最终在细胞内被溶酶体酶溶解失活，受体本身又返回到细胞表面。BNP较ANP对NPR-C的亲和力低，因此，其生物半衰期期约23分钟，是ANP（约3分钟）的7～8倍。NT-ProBNP生物半衰期大约为1-2小时，这也解释了心衰患者血液中NT-ProBNP浓度高于BNP的原因。BNP还可以通过酶促反应被降解清除,体内有一种中性肽链内切酶(NEP),是一种含锌(Zn)的金属肽激酶，对ANP和BNP均有高亲和力，可促进BNP从循环中被清除[6,7]。
BNP生物活性作用主要包括[7]：（1）BNP可通过不同机制来影响循环系统血压，拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用以及反馈调节脑部心血管中枢的活动，降低迷走神经传出冲动阈值从而抑制心搏过速反射和血管收缩，并能增加冠状动脉和肾血流量。（2）BNP通过抑制肾小球入球小动脉球旁器的致密斑释放肾素，抑制肾上腺皮质球状带细胞合成和释放醛固酮，提高肾小球滤过率和促进排尿。其利钠、利尿作用还因肾远曲小管增加水、钠排泄和减少集合管对水、钠的重吸收而进一步加强。当心衰 、肾衰 、肝硬化腹水等吸收体液或盐过多产生水肿性紊乱导致心房或心室容量负荷增加、侧壁压增高时，利钠肽类激素释放増多。（3）降低全身及肺血管阻力和全身及肺血管血压（前负荷）,降低静脉回流量（后负荷）,降低心房、心室舒张未期压力等，提高心输出量和改善舒张功能。（4）调控心血管细胞增生和肥大的进程。阻断ANP,BNP基因表达或ANP，BNP与受体结合则导致血压增高和心肌肥大并继发肾对容量负荷的反应性受损。BNP还被认为是来源于心肌细胞的抗纤维化因子[8]。
2.BNP检测方法及影响因素
目前对BNP的检测通常运用抗BNP单克隆或多克隆抗体建立起来的免疫学测定方法。一般使用两株匹配的抗体，其中一株可以识别BNP分子的C—端区，另一株识别分子内环结构，分别作为捕获抗体和检测抗体。另一些方法则是通过检测BNP前体氨基端片段 NT-ProBNP血浆浓度来研究其变化与疾病的关系。2001年11月美国FDA批准了第一个BNP检测试剂盒（Biosite Dignostics）在美国上巿,从而使BNP检测有可能成为临床实验室常规测定项目，该方法目前主要用于对心衰的诊断和分期[10]。
BNP的免疫学测定方法有放射免疫法（RIA）、高灵敏度的免疫放射法（IRMA），酶免疫法（EIA），微粒子酶免疫法(MEIA),免疫荧光法（FIA）等。EIA及RIA法测定BNP时，血浆标本均须经过抽提浓缩10倍以上，需要1毫升以上血浆标本,并且反应时间长达18-24小时,不适于常规操作。且RIA法有放射性污染问题，有一定局限性。IRMA法准确敏感,但亦较为费时费力，须经过温育过夜的实验步骤,自动化程度不高，也存在放射性I125对环境及操作人员的损害[11，12]。
BNP及其激素前体氨基端片段 NT-ProBNP检测方法近年来不断优化，自动化程度日益提高，成为简单、适用的常规方法。其中，TRIAGE分析仪是Biosite公司提供的手提式测定仪，采用免疫荧光法测定全血或血浆BNP水平，测定方法很简单，在层析板的加样区加入250ul全血或血浆,渗入反应区后与鼠抗人BNP荧光抗体结合，仅需15-30分钟，即可测得结合物的荧光强度及BNP浓度。该法检测的线性范围可达5～1300pg/ml, 测定值与其它方法相关性良好，是一种快速的床旁试验方法（POCT）[10]。 Abbott AxSym BNP检测法是一个新的全自动免疫化学分析法，采用BNP特异的单克隆抗体和二步夹心分析技术测定血浆BNP水平。样品中的BNP被包被在乳胶微粒子颗粒上的抗-BNP抗体捕获，微粒子在纤维网上进行清洗分离，结合在纤维网上的BNP再与碱性磷酸酶标记的另一株单抗结合。通过对荧光底物磷酸-4-甲基伞型酮催化反应所发出的荧光信号进行检测，和已知浓度的标准物荧光信号强度进行比较，可得到待测样品中BNP浓度。本法检测范围可达0～4000pg/ml，变异系数小于7.6%。分别用Abbott AxSym BNP和Biosite Triage BNP对150例血浆标本进行测定，两法相关系数为0.95，斜率为0.94，说明两者之间有极好的相关性[12]。
最近Roche推出了NT-proBNP测定试剂盒,利用两种多克隆抗体,分别在氨基酸1- 21和氨基酸39–50，直接抗 NT-proBNP，采用夹心法免疫分析和电化学发光技术测定样本NT-proBNP浓度,检测线性范围5 - 35,000 pg/ml，总变异系数 2.2 - 5.8 % ，与BNP, ANP, CNP的交叉反应< 0.001% ，也是一种全自动分析方法，整个测定过程可在30分钟内完成[13]。
人外周血中BNP水平随年龄变化而改变，75岁以上非心衰老龄人血液BNP平均水平较45岁以下人群升高可达1倍以上。同时存在在男、女性别间的差异，正常人群中同年龄段的女性较男性稍高。样品采集应该在受试者安静状态下进行，将所采集的静脉血（约3～4ml）置于EDTA抗凝的塑料管内；在室温下，必须于2～4小时内测定完毕。若样品在2～8℃条件下储存，则放置时间可延长到24小时，如果标本需要保存1个月以上，则需将血浆分离后，放置于-20℃以下的冰柜中保存。文献指出，室温下用抗凝全血测定BNP应在标本中加入适量抑肽酶 ，否则测定值会偏低。饱食、运动、情绪激动状态、体位和姿势、服用某些药物等均会对测定结果产生影响，因此应强调在标准条件下采集血液标本。标本不宜用玻璃试管收集，不推荐使用血清及或其他抗凝剂如肝素锂等[14] 。
各种市售BNP测定试剂盒由于使用的抗原标准品，单抗来源以及抗体所针对的BNP、ProBNP抗原决定簇不同，这些检测方法在灵敏度、特异性等方面存在差异。由于不同实验室对同一份样品的测定值不一致，对判断测定值的临床意义造成了困难[8-11]。因此，首先应针对各种测定方法建立相应的正常人及各种病理状态下的测定参考值范围。就目前的现状而言，BNP检测方法的标准化还有很长的路要走。
3.BNP与心血管疾病的关系
3.1心力衰竭 心力衰竭（Heart failure,HF）是一种心脏泵血功能异常不能满足机体组织代谢需要的一种病理生理状态。心衰的关键诱因是大量心肌纤维因急性心肌梗死、毒物、感染或持续心血管牵张状态等而导致收缩功能降低。心衰综合症分为充血性心衰或舒张性心衰,后者是一侧或两侧心室灌注压异常增高而产生的。心脏有多种机制以维持其泵功能，其中最主要的是Frank-Starling 机制。当心脏后负荷增高时常以心肌肥厚作为主要的代偿机制。此外,神经体液系统在心衰的进程中扮演了重要角色[13]。
BNP对心衰的检测价值近年来已被广泛接受。现在认为BNP是心衰患者非常有力的诊断和预后的标志物。BNP的检测也为心功能的分级提供了更加可靠的依据。Wieczorek SJ等[14]比较测定了严格按美国纽约心脏病协会（NYHA）心功能分级标准诊断的慢性心衰（CHF）患者血浆BNP水平，心功能Ι～Ⅳ级CHF患者血液BNP浓度均值分别为81.3pg/ml,235pg/ml,459pg/ml和1119pg/ml,较正常人9.3pg/ml明显增加，且随心功能的损害程度加重呈显著上升趋势。若以100pg/ml为cut off 值，BNP对CHF的诊断效能是：敏感度90%，特异性76%。BNP浓度值对于心衰患者的治疗效果监测也有帮助，治疗有效的患者血液BNP水平较治疗前明显降低。
快速检测血液中BNP浓度在急诊室可用于区别充血性心衰与原发性肺部疾病引起的呼吸困难，Dao Q等[15]研究了充血性心力衰竭病人（N=99），有呼吸困难的非CHF患者（N=139）血液BNP水平，BNP测定值(X±S)分别为1076±138pg/ml和38±4pg/ml，两组间BNP水平有极显著性差异(P<0.0001)。
BNP水平测定对改善失代偿充血性心衰患者住院管理是一种有效方式。心衰早期BNP分泌已明显增高，BNP水平对心衰死亡率及心脏事件有很强的预见阳性率。Takayoshi Tsutamoto等[16] 对85例CHF患者（含左心室功能障碍,LVD）,按其BNP浓度的中位值(73pg/ml)分成两组来分析其累积存活率，结果表明，BNP>73pg/ml的一组50个月内死亡率明显高于另外一组，经统计学分析,P<0.0001,有极显著性差异。BNP指导的心衰治疗不仅降低了心血管事件发生率，同时与强化临床指导治疗相比甚至延迟了第一次事件的时间。
3.2左心室功能不全
测定血浆BNP水平可帮助左心室机能障碍（LVD）的诊断，用于筛查高危的无症状的LVD病人，Maedar等[17]在对72例左心功能不全患者的研究中发现，血浆BNP水平与心导管测得的左室舒张末压（LVEDP）均增高，而经血管紧张素抑制剂（ACEI）治疗的患者血液BNP浓度明显降低。对于已确诊为缺血性左心室功能障碍接受ACE抑制剂和利尿剂治疗的患者，BNP水平是患者发生心衰或死亡的特异性预测因子。Maisel AS等[8]报道：血浆BNP水平在心衰、左心功能不全和非心衰患者分别为675±225、346±390和110±225pg/ml。BNP适用于筛选有症状的HF或用于帮助初诊医生鉴别需要作进一步检查的高危个体。但BNP与NT-proBNP均不适合用于鉴别轻度收缩功能不全(LEVF<40%)或保持收缩功能的普通门诊病人[18]。
测定血浆BNP水平可帮助诊断左心室机能障碍（LVD），并可用于筛查高危的无症状的LVD病人，Maedar等[17]在对72例左心功能不全患者的研究中发现，血浆BNP水平与心导管测得的左室舒张末压（LVEDP）均增高，而经血管紧张素抑制剂（ACEI）治疗的患者血液BNP浓度明显降低。对于已确诊为缺血性左心室功能障碍接受ACE抑制剂和利尿剂治疗的患者，BNP水平可用于预测患者发生心衰或死亡。Maisel AS等[8]报道：血浆BNP水平在心衰、左心功能不全和非心衰患者分别为675±225、346±390和110±225pg/ml。BNP适用于筛选有症状的HF或用于帮助初诊医生鉴别需要作进一步检查的高危个体。但BNP与NT-proBNP均不适合用于鉴别轻度收缩功能不全(LEVF<40%)与保持收缩功能的普通门诊病人[18]。
有关BNP对舒张性左室功能不全的诊断作用，Troughton RW等经超声心动图测定左室灌注压峰值升高或左心室舒张未压力升高的病人，运用ROC曲线分析,曲线下面积是0.7-0.9，显示出良好的诊断价值[18]。BNP与动态超声心动图测定LVEF的结果有较好的相关性，并且与核素心室造影显示的左室循环灌注峰值呈显著相关[17]。特发性扩张性心肌病患者灌注峰值为左心室舒张功能指标，与血浆BNP进行相关性分析，发现两者密切相关。对LVEF水平相近，同等程度的收缩性左心功能不全患者，其血浆BNP水平明显高于舒张期左心功能不全者。对某些保持了收缩能力的严重舒张功能损伤的心脏病人（如肥厚性心肌病、心肌淀粉样变），BNP水平也明显增高。但BNP似乎并不适用于常规筛选未经选择的无症状LVD病人。各种形式的利钠肽联合检测并不能提高诊断准确性[14]。
Hunt PJ等[19]的研究结果表明，NT-ProBNP 与BNP没有特别大的差异，因此可作为一项新的标志物来检测左心室功能障碍。文献对NT-proBNP和BNP用于LVD检测的结果进行了比较,证明了两者间呈高度相关(r=0.88)。而且NT-proBNP与LVEF的相关性分析结果和BNP也很接近。与正常对照组相比NT-proBNP比BNP增高更多,提示NT-proBNP用于识别早期LVD可能比BNP更有意义[20]。
3.3 AMI危险度分层 AMI伴随着神经体液系统的激活,包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统,交感神经系统,并可见血管加压素和肾上腺素分泌增加等。 AMI急性时相ANP和BNP水平显著升高,ANP于早期即达峰值, 随即下降,之后又上升。BNP、NT-proBNP约在入院16小时后升高达峰值,随后开始下降。在LVD患者往往出现AMI亚急性时相第二个峰值。这种双峰现象多见于出现Q波的AMI,通常还同时有高水平CK-MB峰值出现。令人感兴趣的是在AMI早期使用ACE抑制剂治疗的患者大多只出现BNP单个峰值。AMI后90天BNP仍维持高浓度则说明心室重构在持续进行[21]。
一般认为BNP不能用于心肌梗死的诊断，而主要作为AMI亚急性时相预测患者再发生心梗及远期死亡率的心脏标志物。心梗患者BNP分泌的程度和时相取决于左心室机能障碍的程度，急性心梗发生后2-3天内往往出现一过性BNP水平增高，而BNP持续增高则说明出现明显心衰，且死亡危险度高。这种危险度分级，不能通过测定ANP而获得。和LVEF一样，发生AMI 2-4天后，BNP及NT-ProBNP水平可预测左心室功能以及2年内的存活率，在多因素分析中是独立的有价值的预测因子。通过血浆BNP或NT-ProBNP的检测可以将患者分为低危或高危群，因此心梗发作后BNP或NT-proANP检测应作为常规检查内容[22]。
3.4 冠状动脉疾病 冠状动脉疾病是导致心衰的主要致病因素，主动脉狭窄（AS）患者血浆BNP浓度升高，且随着AS的严重程度而上升，但其预测价值较差。实验研究与临床调查都说明缺血、低氧能刺激心肌细胞释放BNP。 在心脏冠状动脉旁路移植手术发生麻痹性心肌停搏后，当冠脉血管再灌注时，BNP释放显著增加，并且BNP水平与心肌细胞乳酸生成量密切相关[23]。
3.5 其他疾病 BNP在部分高血压病人血液中呈轻到中度升高(20%-100%),其增高幅度与心脏重量指数,左心室肥大及舒张性LVD有关.BNP在肾衰病人显著升高,一般认为体液容量的扩张是引起BNP分泌增加的主要病理生理机制。经血液透析的患者BNP明显降低。此外,肝硬化腹水病人、高醛固酮血症等水潴留性疾病亦见BNP升高[24]。
4．BNP的检测及其临床应用展望
BNP作为一个极有临床价值的实验室检查项目，吸引了众多学者的关注。相信将来BNP检测可能会成为心衰确诊中不可缺少的一项指标。BNP不但可以为HF患者预后评价提供重要信息，还能提高NYHA心功能分级的客观性，并可用于指导ACS患者危险性评估和治疗效果的评价。实验室检测BNP的标准化工作有着极为重要的意义，如果不同实验室对BNP的检测结果都依据相同的参考值范围，相互之间具有可比性，那么对于临床使用就更有指导作用。 在我国，关于BNP检测工作还处在起步阶段。一种新的标志物被临床接受并得到合理应用往往要经历一个较长的阶段。由于缺乏符合我国实际的BNP参考范围（包括不同年龄组和不同心衰程度时）以及其他一些因素影响，使其临床应用受到很大限制，建立一个适合我国人群的BNP/NT-proBNP参考范围迫在眉睫。
参考文献本回答被提问者采纳