细胞冻存的操作步骤是什么？

Question

如题所述

Answer 1

1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2、取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3、去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

4、离心1000rpm，5min；

5、去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

6、细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

7、在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

8、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

注意事项

1、从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞用于冻存，最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；

2、将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；

3、冻存和复苏最好用新配制的培养液。

Answer 2

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；
4. 离心1000rpm，5min；
5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞冻存管融化
1.将细胞冻存管取出，浸入37℃水浴锅内，轻轻晃动，注意融化，当融得只剩一个小冰块时，将细胞插入冰中。
2.加入4℃预冷的培养基，用手指轻弹悬浮细胞团。
3.250g离心10min，去除上清液，再加入培养基，轻轻悬浮。
4.尽量将细胞中的DMSO洗去，计数。

在细胞冻存过程中，所结的冰晶对细胞伤害较大，所以过程一定要慢，DMSO能减少冰晶伤害。在细胞复苏过程中，要快，以减少融化对细胞的伤害，其实还是冰晶的问题。DMSO浸润的细胞非常脆弱，所以可要尽快将DMSO去除，一定要轻。

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