免疫组化注意事项?

Question

如题所述

Answer 1

做免疫组化前需要注意的方面：

1、抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重，此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。

2、石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，一般用6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。

3、注意检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。

4、抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的speciesreactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。

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5、抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4℃孵育过夜和37℃复温45min；二抗我一般37℃30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。

6、抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般初次做一种新抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高还是低方向摸索。

一般先决定二抗的浓度（工作液就好办了，直接滴加），重点摸索一抗的最适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。

7、血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调整，封闭主要是降低切片的总体背景着色。

8、细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞核蛋白，建议还是通透一下，促进抗体等试剂充分进入参与反应。

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扩展资料：

一、免疫组化的分类：

1、免疫荧光细胞化学技术：将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光，从而可以确定组织中的抗原定位或定量。

2、免疫酶细胞化学技术：是目前免疫组织化学研究中最常用的技术，基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。

3、免疫胶体金技术：就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究。由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究。

二、免疫组化的原理：

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。

由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

参考资料来源：/baike.baidu.com/item/免疫组化/10004329?fr=aladdin"target="_blank">百度百科-免疫组化

Answer 2

1、
标本的固定
组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始。离体组织应尽快的进行取材固定，最好20分钟内，因为有些抗原若固定不及时可能就检测不到了。而对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但在病理常规工作中很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定。组织固定时间最好在6-24小时内，一般组织固定时间不应超过24小时，随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。另外，非中性福尔马林缓冲液、含酸和含汞固定液亦可导致标记失败或减弱。
2、
蜡块的选择
正确选择用于免疫组化的蜡块也是确保染色质量的关键因素之一。很多病例的组织蜡块不止一个，不同的蜡块中，组织成分常常并不完全一样，一般选择最具代表肿瘤特异性的蜡块，最好含有内对照。更值得注意的是，所选取的蜡块除了要包含代表肿瘤特异性的组织外，应尽量避免含有出血、坏死和脂肪组织。这些组织内的抗原大多已被破坏或丢失，最终通常呈片状弥漫染色，除影响制片的美观外，容易导致误判或误诊。而且这些组织通常影响切片的质量。另外，最好不要选择冰冻剩余组织或脱钙组织，冰冻或脱钙一般也会影响组织内的抗原。
3、
修复方法的选择和对比
抗原修复是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原进行暴露和修复，使抗原性得到一定程度的恢复过程。修复的方法有酶(胰酶、蛋白酶等)消化、加热法(水浴、微波和高压煮沸等)和超声处理等，或者综合利用以上方法。目前最常用的是加热煮沸法，少数用酶消化法。大量实验表明，固定时间越长的标本，所形成的交联就越紧密，抗原就越难以被激活，所需的修复强度也就越强。各种修复方法染色强度的比较为:高压法>水浴法>微波法。在日常工作中，要根据不同抗原的特性选择合适的修复方法。抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液(pH
6.0)、EDTA缓冲液(pH
8.0~9.0)等。修复液的PH值对染色结果也会产生相当大的影响。研究发现在高PH值约pH8.0~9.0时，都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值的修复液，尤其是对核阳性的抗体。
4、
确定阳性对照
免疫组化染色过程比较复杂、影响因素也很多，故应设置阳性对照和阴性对照。尤其是阳性对照尤为重要。阳性对照包括两种，一种为内对照，这是一种比较理想的对照，对照和测试组织都在同一张切片中，都处于相同的实验条件下，结果更可靠也更具有可比性。另一种称为外对照，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照。阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。因此，一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。