真菌染色方法的探讨
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更新时间：2006-04-22 08:38:39 作者：广州市胸科医院病理科:邓晓华
一、概述
真菌是指具有真正细胞核、产生孢子、不含叶绿素，以寄生或腐生方式吸取养料，能进行有性和(或)无性繁殖，具有纤维素(或其他葡聚糖)或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、TB、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量X线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件．近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。
真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌：主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床最多见的浅部真菌病有：体癣、股癣、手癣和足癣。深部真菌：指侵犯表皮以外组织和器官的病原菌和条件致病真菌.；按生物学性状的不同又分为：酵母型、酵母样型、丝状菌型、双相型。深部真菌常见的有：念珠菌，隐球菌，组织胞浆菌,马尔尼菲青霉菌，曲霉，毛霉菌,孢子菌丝等。
二、常见真菌的形态特征
真菌的大小差异悬殊，大者如碗口，不属微生物范畴，例如灵芝；小者肉眼看不到，只能用显微镜观察。真菌的形态分单细胞和多细胞两种类型，单细胞真菌呈圆形或卵圆性，常见于酵母菌和酵母样菌；多细胞真菌多呈丝状，分枝交织成团，也称为丝状菌，即一般通称为霉菌。
三、真菌的基本结构
真菌由菌丝和孢子构成。孢子是真菌的生殖结构，分为有性孢子和无性孢子。在适宜条件下，菌丝是由孢子生出芽管，逐渐延长呈丝状，生物学上把真菌的每一根细丝叫做菌丝。
四.真菌的染色方法
真菌用H-E染色一般着色不良，因此需用特殊的染色方法来显色，六胺银法（GMS）用铬酸氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基还原六胺银内的银离子为黑色的金属银而显色。PAS法用高碘酸氧化真菌菌壁的多糖游离出醛基，后者与无色品红结合生成新的品红色复合物而被显色。这两种方法可显示大多数真菌，是最广泛最常用的染色方法。
近年来，有报道用网状纤维的染色方法（G-S）来显示真菌，特别是曲球菌的染色显示效果较佳。现对常见的几种真菌作以下三种染色方法进行探讨。
（一） 六胺银染色方法(GMS)
1.操作方法：
⑴ 切片脱蜡至水。
⑵ 8%铬酸水溶液氧化20分钟，自来水稍洗。
⑶ 0.5%偏重亚硫酸钠液处理1分钟，流水冲洗5分钟，再用蒸馏水洗2次。
⑷ 浸入已预热（约15-30分钟）的六胺银工作液中分三种方式处理：
①水浴锅内恒温处理（50-52℃）：先将已盛有六胺银工作液的5片装高身染色缸置入水浴锅内预热15-30分钟，再将处理好的玻片置入六胺银工作液中反应30-60分钟，中途显微镜观察，至见到菌丝呈黑褐色为止。
②电热恒温箱内处理（58℃-60℃）：方法同上，在六胺银工作液中反应的时间较长需60-90分钟, 蒸馏水稍洗.
③微波炉滴染：取微波炉专用蒸盒，底放50ml水，用于吸热保湿；玻片放置隔层，滴加六胺银工作液于组织上，火力3档5-6分钟,蒸馏水稍洗.
⑸ 滴加0.1%氯化金溶液调色2-3分钟,蒸馏水洗。
⑹ 3%硫代硫酸钠液处理2-5分钟, 流水冲洗5分钟。
⑺ 用橙黄G复染1-2秒（首选）或用Mayer氏苏木素浅染，伊红复染。
⑻ 常规脱水透明封片。
2．染色结果：
各种真菌均被着色，菌丝和孢子呈明显的黑褐色。背景为：橙黄色（橙黄G复染），红色（伊红复染）。
※3．注意事项：
六胺银染色是显示真菌效果最佳的一种方法，为了获得菌体及背景清晰的染色效果，首先必须做好准备工作，染色过程需用的玻璃器皿要洁净，尽量避免使用过久的蒸馏水配制试剂，建议使用双蒸水，这样才能保证六胺银工作液的纯度，避免杂质沉淀影响观察。其次病理技术人员应掌握常见真菌的一般形态特征，并根据实验室的具体情况选择合适的孵育条件，摸索孵育时间和温度。在显微镜下观察染色程度时，低倍镜下颜色不要太黑，至深棕褐色即可，经0.1%氯化金溶液调色后，真菌从深棕褐色变成棕黑色，真菌壁和孢子着色。
4．过染的补救措施：
可用1%铁氰化钾与2%硫代硫酸钠1:1混合备用，临用时将此混合液再稀释2-3倍，滴入玻片上使组织减色，镜下观察。
（二） 高碘酸—无色品红(PAS) 法
1．操作方法：
(1) 切片脱蜡至水。
(2) 0.5%高碘酸氧化5-8分钟。
(3) 流水冲洗2分钟，再用蒸馏水洗。
(4) 入无色品红液于暗处并加盖作用10-20分钟。
(5) 0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次，每次约1分钟。
(6) 流水冲洗5分钟。
(7) 0.2%亮绿水溶液复染。
(8) 稍水洗。
(9) 常规脱水透明封片．
2．染色结果：
真菌菌丝和孢子呈品红色，其他组织绿色
3．注意事项：
无色品红液(Schiff氏试剂)的试剂配制主要是试剂的纯度要高，才能配制出理想的无色品红液，染色才能成功。
（三） 银氨液浸染法（G-S法）
1.操作方法：
(1) 切片脱蜡至水
(2) 切片滴入0.5%酸化高锰酸钾液，氧化5分钟，稍水洗。
(3) 2%草酸水溶液漂白1-2分钟，稍水洗。
(4) 2%硫酸铁铵水溶液媒染5分钟，再用蒸馏水洗一次。
(5) 滴入G-S氏银氨液作用10-30秒，蒸馏水稍洗。
(6) 10%中性甲醛液还原30秒，流水冲洗数分钟。
(7) 滴加0.1%氯化金溶液调色2-3分钟（镜下观察），水稍洗。
(8) 3%硫代硫酸钠液处理2-5分钟（镜下观察），流水冲洗5-10分钟。
(9) 核固红液复染5-10分钟，稍水洗，常规脱水透明封片。
2.染色结果：
网状纤维及真菌呈棕黑色，胞核红色（核固红复染）， 胶原纤维黄棕色，胞质淡红色（伊红复染）。
3.注意事项：
⑴ 配制银氨液的蒸溜水要纯，滴入银氨液作用不要超过1分钟，最好控制在10-30秒已足。
⑵ 10%中性甲醛还原不要超过1分钟，最好控制在30秒，否则容易出现银氨沉淀，影响观察。
五、几种真菌的显示特点
1．新形隐球菌在镜下多呈圆形，直径为4-20微米 ，菌体周围有一层宽阔的具有折光性的胶质样荚膜包绕，荚膜厚3-5微米，为一种粘多糖物质所组成，爱先蓝染色和粘液胭脂红染色呈阳性反应。六胺银染色也能很好地显示菌体的特征，但必须掌握染色程度，显色太浅，隐球菌的夹膜不明显，显色太深，则分不清夹膜和菌体。
2． 组织胞浆菌病的感染途径是通过吸入荚膜型组织胞浆菌的分生孢子后感染所致的全身性真菌病，主要侵犯机体的网状内皮系统。组织胞浆菌病是一种典型的双相性真菌，在人体组织中是酵母型，大部分病变中均可在巨噬细胞内找到很多的病原菌。HE染色见菌体为小圆形或卵圆形，直径很小只有1-5um，有明显的细胞壁。PAS染色（首选）菌细胞壁阳性。六胺银染色也能清晰的见到病原菌，菌细胞壁呈黑色。
3．马尔尼菲青霉菌是较罕见的真菌病，是已知唯一的双相性青霉菌，该菌在人体组织中酷似组织胞浆菌，其镜下是一种2.5-3微米的圆形或椭圆形酵母细胞，它所具有的特征性标志是腊肠形分隔的孢子。本病易与组织胞浆菌混淆，（1）组织胞浆菌在组织胞浆内呈淡蓝色核点，周围有空晕，但无“腊肠”状菌体、中部无横隔。（2）马尔尼菲青霉菌有双相性，即在不同温度下培养呈不同形态。25℃培养呈灰褐色绒毛状菌落，培养基呈玫瑰红色，镜下为菌丝相；37℃培养呈灰褐色粗糙的酵母样菌落，镜下为酵母相。组织胞浆菌虽然也有双相性，但不产生红色色素。六胺银染色（首选）可以很好地显示出它的特征，但要熟练掌握好温度和时间，建议用橙黄G复染，这样底色清晰，能更好的发现椭圆形或腊肠状的菌体,中央有一着色较深较粗的横壁。马尔尼非青霉菌的淋巴结组织不适合选用银氨G-S染色方法；PAS染色也很难发现椭圆形或腊肠形分隔的孢子。
4．念珠菌为圆形或椭圆形生芽的酵母样菌，壁簿，由芽管延长而形成的假菌丝长而直，有分隔，少数有分枝，芽生孢子和假菌丝同时见到才可诊断为念珠菌，通常陈旧性病灶或病灶深部菌丝较多，而病灶浅部的孢子较多。六胺银法和PAS法都能很好地显示出念珠菌的孢子和假菌丝。
5． 烟曲霉的营养菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，在切片内有时可以清楚的看到孢子；分生孢子头短柱形，长短不一；分生孢子梗光滑，近顶端膨大形成倒立烧瓶状顶囊。顶囊有单层小梗，较长，黑棕色密集排列呈栅状，布满顶囊表面4/5。
6． 曲霉是较常见的一种真菌，营养菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，粗细均匀，两侧菌丝壁平行，有横隔，常呈45度锐角分枝，呈放射状或珊瑚状排列。曲菌常在组织空腔内大量繁殖，其菌丝缠绕在一起形成团块，称曲菌球。六胺银法、PAS法和银氨G-S法染色都能很好地显示菌丝体，营养菌丝体着色较深，反之着色较浅。
7．毛霉菌主要侵犯肺，脑和其它器官,最常侵犯血管引起血栓形成和血道播散，毛霉菌菌丝粗大,壁厚，两侧壁不对称 ,宽窄不均,不分隔 ,菌丝偶有分枝而不规则,呈钝角或直角分枝,有时菌丝可呈直管状 ,有些又像枯枝状。用六胺银法、PAS法和银氨G-S法都能很好地显示毛霉菌菌体。
8．放线菌按生物学分类属于细菌，有细胞壁，其化学组成与细菌相似；由于所引起的病变与真菌相似，故多把它归为真菌类介绍。
近年来，由于临床上大量使用广谱抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂及进行大量的放疗，其结果造成机体内菌群失调和菌群交替，使作为条件致病的放线菌引起的机会性感染发病率急剧上升。
放线菌的菌落由大量菌丝交织而成，周边部分菌丝成放射状排列，故称为放线菌。H-E染色中可见放线菌丛（肉眼观察为硫磺样小颗粒）。菌丛中央由交织成团的菌丝构成，呈紫蓝色，周边部分为放射状排列的菌丝未端，呈棒状膨大和红染。革兰氏染色阳性。六胺银染色能把菌丝和胶样鞘都显示出来。放线菌常侵犯人的颈面部，腹部和胸部亦可侵犯肠壁、肝和肺。
六、三种染色方法的比较
1. 六胺银染色
① 六胺银染色能显示大多数真菌,是显示真菌效果最佳的一种方法。
② 本实验中的7种真菌和1种细菌染色效果都十分理想。
③ 六胺银染色能很好的将真菌特点显示出来。
④ 六胺银染色中的微波炉滴染方法由于大部分使用家用微波炉,不能控制温度,效果不稳定。
⑤ 六胺银染色操作虽然繁琐,技术要求较多，需要积累并不断总结经验，才能获得菌体及背景清晰的染色效果。
2．PAS染色
① 操作简单,时间短，不容易过染。
② 能较好的显示大多数真菌,包括单细胞型和多细胞型真菌。
③ 个别真菌局部着色不良。
④ 建议做PAS染色时也做六胺银染色,有利于观察判断。
3．银氨G-S染色法
① 操作简单,时间短,只需十几分钟.
② 能显示大多数真菌（较适合染多细胞型真菌）。由于大量的网状纤维影响观察，故不适合染淋巴结内真菌感染的切片。
综上所述，三种染色方法各有利弊，其中六胺银染色是显示真菌效果最佳的一种方法，并且能显示另外两种方法所不能显示的真菌结构，对真菌病的诊断具有确诊的价值。
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