解决方案是加强保留,若不改变固定相,可向流动相中加入添加剂抑制被测物电离,最极端的就是离子对色谱。或更换色谱柱,使用HILIC模式、可耐纯水相的色谱柱、反相与离子交换的混合填料等。具体还是要看目标物结构。其实反相分离还是可以解决很多问题的。注意流动相pH和样品的溶液都要使目标物呈游离态,有利于更好的保留。如果不介意,可以把样品结构发给我,以及可能的杂质结构等。单纯的C18固定相往往不适合极性太强的分子,比如多糖、核酸。解决方案是加强保留,若不改变固定相,可向流动相中加入添加剂抑制被测物电离,最极端的就是离子对色谱。或更换色谱柱,使用HILIC模式、可耐纯水相的色谱柱、反相与离子交换的混合填料等。如果是以纯化为目的,还可考虑使用大孔树脂。
反相色谱法(Reverse Phase Chromatography, RPC)是分离大多数常规样品的首选分离模式,该模式一般比其他色谱模式的普适性更好,令人满意的分离度也让反相色谱法成为最广泛应用的纯化方法。然而反相色谱法对于亲水性化合物却不能很好的分离,使用普通的反相色谱柱,这类亲水化合物都难以有效地保留。而Hilic柱对于这类化合物不仅有合适的保留时间,还有令人满意的分离度。
常州三泰科技公司的SepaFlash® Hilic柱与快速液相制备色谱系统SepaBeanTM machine结合有着优越的分离性能,本文比较了SepaFlash® Hilic柱与SepaFlash® C18柱在反相模式下对于两种强极性化合物的分离效果,实验结果表明SepaFlash® Hilic柱有着优秀的分离效果,为此类化合物的分离纯化提供了一套高效且实用的解决方案。
根据分离图谱,我们能准确测得保留时间与峰宽,可用公式计算相应的分离度:
R = 1.18 (t2 - t1) / [(W1/2)1 + (W1/2)2式中t1与t2分别为相邻谱峰的保留时间,(W1/2)1与(W1/2)2是半峰高处测得的峰1和峰2的峰宽。根据公式分别计算图4和图5中相邻谱峰的分离度,SepaFlash® C18柱中相邻谱峰的分离度R≈1.53,SepaFlash® Hilic柱中相邻谱峰的分离度R≈5.97。通过计算分离度可以看出,SepaFlash® Hilic柱的分离度要远远超过SepaFlash® C18柱。实验结果表明,SepaFlash® Hilic柱表现出了卓越的选择性,成功地保留和分离了胞嘧啶和维生素C的混合物。根据分离图谱可以看出,即使在SepaFlash® C18反相柱上以高达95%的水溶液流动相来分离,这两种强极性化合物也只有很弱的保留,并且混合物样品没有得到基线分离。对比C18反相柱的分离结果,我们可以看到混合物样品在SepaFlash® Hilic柱上不仅有合适的保留时间,而且有理想的分离度。因此,本文中的方法为强极性化合物的快速分离纯化提供了一套高效且实用的解决方案。