酶标记抗体的简易过碘酸钠法

Question

如题所述

Answer 1

本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。 (1)　称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2)　于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)　将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)　加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)　加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
(6)　将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。
其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。 除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62 (1)　0.1M NaIO4：称取214mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
(2)　1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:
0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml
加蒸馏水至2,000ml。
(3)　0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:
Na2CO3 0.32克
NaHCO3 0.586克
加蒸馏水至50ml
再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
(4)　NaBH4溶液(4mg/ml):
临用时称取NaBH44mg溶于1ml蒸馏水中。
(5)　其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。