怎么才能设计出好的sgRNA呢？既要考虑切割效率，也要考虑特异性。
切割效率
靶位点的位置：
1、避免靶向基因的N端或C端：避免靶向基因的N端以减轻细胞使用起始密码子下游的替代ATG。而避免靶向基因的C端以最大化创建非功能等位基因的机会。（因为靠近蛋白末端的片段突变不太可能干扰基因表达）；
2、避免靶向5’和3’ UTRs区；
3、有些基因特异性的模式，如空间位阻等也会降低基因编辑效率。
特异性
截短gRNAs （trugRNAs）
crRNA序列小于20个核苷酸，可以减少脱靶位点突变多达5000倍或更多，而不牺牲靶基因组编辑效率。具有17或18个核苷酸的截短gRNA称为“trugRNA”。
17个核苷酸是实现有效基因编辑的最小长度。
根据经验，还是推荐大家使用18-19bp的trugRNA，有些17bp的trugRNA可能不起作用。（可能的原因是：20bp的gRNA对其靶位点具有比所需更多的亲和力，因此18-19bp的trugRNA也会起作用，而且trugRNA可能使tru-RGN/DNA复合物对错配更敏感。）trugRNA可以有效地在人类细胞中引入靶向插入缺失（indel）或HDR介导的基因组编辑事件。
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