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1 前言
多糖是存在于自然界的醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物。多糖是一切有生命的有机体必不可少的成分，它与维持生命的种种生理机能有着密切的联系。近年来，植物、海洋生物及菌类等来源的多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，各种多糖所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。多糖具有复杂的结构，这是因为它具有许多不同单糖残基、不同的连接位置和不同类型的糖苷键，能形成具有不同的构象、不同的相对分子质量，以及链内和链间氢键的二级结构。
对多糖的研究，最早是在20世纪40年代，但其作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视则是在60年代,经过40余年的不断发展,人们对多糖这一类重要生命物质产生了新的认识, 使这一学科成为目前生命科学中研究最活跃的领域之一[1]。越来越多的研究发现多糖对人体具有极大的利用价值,按其来源可分为三类: 动物多糖、植物多糖和微生物多糖。其中植物多糖如人参、黄芩、刺五加、芦荟等所含多糖均具有显著的药用功效, 如免疫增强作用, 抗肿瘤作用,抗辐射用等。据文献[2]报道,已有近100种植物的多糖被分离提取出来。这类多糖来源广泛且没有细胞毒性, 应用于生物体毒副作用小,因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。
多糖(polysaccharides,PS)又称多聚糖。其存在于动物、高等植物、微生物(细菌和真菌)及海藻等机体中。多糖具有复杂、多方面的生物活性和功能,可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，如多糖能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗 AIDS 病毒[3]；还具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂作用；促进核酸与蛋白质的生物合成作用；能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老，而且多糖作为药物其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们的极大兴趣。多糖分子量在数万或数百万，植物多糖包括淀粉、纤维素、葡聚糖(如香菇多糖)、果聚糖树胶、粘液质、粘胶脂(如琼脂)等，其中有些免疫激活多糖是癌细胞抑制剂，但特异性较差。20 世纪80 年代，德国的Franz G 等研究组最为活跃，证明许多植物多糖、真菌多糖有抗肿瘤活性。这包括已用于临床的香菇多糖(Lentinan)、云芝多糖(Ps-K，Krestin)、猪苓多糖等。
多糖在医药上还是一种很好的佐剂。近年来又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用。此外它还能控制细胞的分裂和分化，调节细胞的生长和衰老。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。越来越多的植物多糖成分获得了新的开发，其在食品领域中的应用价值得到了发展和证实，为食品工业的快速发展注入了新鲜的活力。近年来，随着人们对多糖及糖结合物在生命科学中作用的认识，以及多糖研究技术的迅速发展和改进，多糖研究异军突起，国际科学界视多糖的研究为生命科学的前沿领域，甚至提出21世纪是多糖的世纪[4]。许多植物多糖具有免疫调节活性，能够增强机体巨噬细胞、淋巴细胞等免疫系统的功能及激活或促进抗体、补体的生成和干扰素的诱生；多糖也可以用于糖尿病的防治，促进胃溃疡愈合和修复，具有抗辐射、降血脂等多种功效。因此，多糖及其衍生物作为生物效应调节剂而成为近年来天然药物的研究热点之一。
因此，对多糖的分离纯化研究具有重要的现实意义。本篇论文主要研究醇沉分级、柱层析等。
2实验部分
2.1主要试剂与仪器
Sephadex DEAE 系列，Pharmacia公司
唾液淀粉酶，美国Sigma公司
SDS凝胶
Coomassie Blue试剂
β-葡萄糖基-Yarive试剂
其它试剂均为分析纯
PD 10 柱， Amersham harmacia Biotech 公司
自动流分收集器
RE52CS型旋转蒸发仪，上海医械专机厂
6010型紫外-可见分光光度计，Angel上海分析仪器公司
2690型高效液相色谱仪，美国Waters公司
2.2 实验方法fficeffice" />
2.2.1 除淀粉
将虎眼万年青粗多糖配成20%水溶液，经唾液淀粉酶37℃酶解除淀粉。
2.2.2 除蛋白
Sevage法除蛋白质：样品水溶液按4：1体积比加入氯仿、正丁醇（比例5：1），离心法（10000rpm、20min）除去形成凝胶状的蛋白质，反复多次（3次）至蛋白质除尽为止。除蛋白的效果用茚三酮反应检测，结果呈阴性（或双缩脲试验）；同时在200～280 nm处测定除蛋白后样品的紫外吸收曲线来检测效果，除掉蛋白质的多糖溶液在260～280nm的紫外吸收峰消失，说明多糖不含有蛋白。
2.2.3 除盐
将以上处理液采用半透膜，通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质，用蒸馏水透析48h。
2.2.4 醇沉分级
粗多糖15g+250mlH2O加热溶解，冷却，加入40％乙醇沉淀，搅拌，放置，抽滤，得沉淀（OC-1），用40％的乙醇共沉淀3次，合并滤液，浓缩。
取上浓缩液用60％乙醇沉淀，搅拌溶解，放置，抽滤，得沉淀（OC-2），滤液再用60％的乙醇共沉淀3次，合并沉淀。得滤液（60％醇溶液）（OC-3）。
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发表于 2009-2-9 14:17 | 只看该作者
2.2.5柱分离fficeffice" />
60％乙醇沉淀（OC-2）溶于热水后与Sephadex DEAE树脂在一个烧杯中混合。平衡后，将树脂置于分液漏斗中并用0.5mol/L NH4HCO3溶液洗涤，分成两个组分：0.5mol/L NH4HCO3溶液洗脱液（OC-2－1）和结合在树脂上的组分（OC-2－2）。
0.5mol/L NH4HCO3溶液洗脱液（OC-2－1）蒸干后溶解在水中，上DEAE柱（4.5×12.0），然后用0.2mol/L NH4HCO3溶液等度洗脱，测定各洗脱液的OD值，用收集管数对OD值绘制洗脱曲线。将同一峰的组分合并，产生7个组分：OC-2－1－a(未结合部分)，OC-2－1－b, OC-2－1－c, OC-2－1－d, OC-2－1－e, OC-2－1－f(1mol/L NH4HCO3洗脱液), OC-2－1－g(1 mol/L乙酸钠洗脱液)。
上述不同组分用UV分光光度计在215和280nm波长下测定吸光度OD值。
减压60℃以下将各组分蒸干，然后用PD 10柱（葡聚糖凝胶层析柱Sephadex G-25M）除去盐和小分子。
用60％醇沉部分热水溶解上DEAE树脂柱，用不同浓度的NH4HCO3：0.2M、0.25M、0.4M、0.5M、1.0M
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