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western蛋白上样针图片
western
blot
蛋白
凝胶电泳经显影如图,一般都是一条条带,为何我这是...
答:
每个泳道条带都很粗,建议减少
上样
量,提高二抗稀释倍数,这样如果有一些稍微弱一点的结合也可以避免掉,看能不能有明显的条带出来。
western
blot试验中遇到的问题,希望能帮到正在苦恼的你~
答:
牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒,对封闭无益。可以在转膜开始之后配好牛奶,在充分搅拌好的前提下,静置于4℃。使用时不要担心牛奶不均而特意混匀,只吸上层部分完全ok。提高
蛋白上样
量;适当增加封闭时间,延长一抗孵育时间;封闭的选择:5%脱脂奶粉? 5%BSA?;磷酸酶抑制剂;样本低温操作,最好是...
做好
western
blot需要注意各种细节,转给需要的你!
答:
1.收样前3min先配制细胞裂解液(现配现用),RIPA:
蛋白
酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul,计算用量。以收集六孔蛋白为例,按比例加入RIPA 1200ul,蛋白酶抑制剂12ul,磷酸酶抑制剂12ul,混匀后置于冰上。(我使用的试剂RIPA裂解液(中),蛋白酶抑制剂混合物(100×),蛋白磷酸酶抑制剂混合物...
western
-blot实验步骤
答:
(1)转膜完毕后,立即把
蛋白
膜放置到预先准备好的
Western
洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。(2)用微型台式真空泵吸尽洗涤液,加入Western封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高...
Western
Blot基本原理及步骤
答:
Western
Blot基本原理及步骤如下:Western blot即
蛋白质
印迹法(免疫印迹试验),它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现已广泛应用于基因...
western
blot实验怎么
上样
答:
首先要设计
上样
的顺序,一般是让与抗体有反应的样品和没有反应的样品间隔开,这样条带之间反差比较明显。比如你的检测样能够与抗体反应,上样就是maker—阳性对照—阴性对照—检测样(N个),如果检测样比较多,可以在检测样后再加上一个阴性对照和阳性对照。上样量一般5-20微升(样品与上样buffer混合后...
western
blot 具体操作步骤
答:
(一)
蛋白质
样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳
上样
缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃,13,000g离心15min。取上清液作为样品。(二)电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。(三)转移:(半干式转移)1、电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲...
蛋白
marker为什么能作为显色条带
答:
蛋白
marker可分为:一、未预染的Marker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Marker即单色预染和多色预染。在
western
Blot过程中,分子量Marker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节,然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。这个
Western
Blot参照家族的一员的...
western
blot
蛋白
样品煮沸时间过长还能用吗
答:
可以用。
western
blot样品煮
蛋白
后结块是经常会有现象。如果是SDS-PAGE,加了
上样
缓冲液后依然煮蛋白后结块,那说明蛋白样品浓度过高,已经超出了SDS可以结合的浓度。建议降低样品的浓度即可。如果没有加含有SDS的上样缓冲液,那么就是蛋白样品被煮沸后变性沉淀了。加入溶解剂即可。
做
western
跑电泳时加样孔里为什么会有残留的蓝色
答:
做
western
跑电泳时加样孔里会有残留的蓝色,是因为有残留的溴酚蓝没有跑下去 可能的原因是部分样品未完全溶解有沉淀,沉淀也被溴酚蓝染色,故电泳时加样孔里为什么会有残留的蓝色 这对做western并没有影响,可以直接把浓缩胶部分切掉只做分离胶部分的转膜 那么残留的蓝色就不会影响到转膜的效果 ...
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