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荧光定量引物退火温度
荧光定量
pcr的扩增步骤中,
退火
可以省略吗
答:
退火温度通常随引物Tm值(常为55-60℃)设定
,延伸温度则普遍用72度(Taq酶,也就是DNA聚合酶活性最高的温度)。因为这三个步骤,我们也可以称它为三步法程序。相对应的,在qPCR实验中,我们最常见的是两步法程序,①变性,②退火+延伸。荧光定量的引物在设计时,Tm选择为60℃左右,而聚合酶在60℃...
荧光定量
PCR的
引物
能直接跑普通PCR吗?
答:
荧光定量pcr的引物相距一般是200bp,如果跟你普通pcr长度相同,
退火温度60度
,那你可以做个预实验,如果预实验没问题那是可以的
实时
荧光定量
PCR中两种
引物
的设计有什么要求
答:
引物长度,20bp;
Tm值可以设置在55度(实验的时候可以用60度退火
,两条引物的退火温度不要相差大于2度);产物长度,100-150bp(如果没有合适的引物,产物长度可以设置在80-200)。如需设计引物,可以微信搜索“为青生物”,由专业人员提供免费的荧光定量PCR引物设计服务。
为什么在PCR反应过程中,使用三个不同的
温度
变化
答:
第一个一般在94-95度左右
,叫做变性,就是通过加热打开双链。第二个温度点叫做退火,根据引物的TM算出,一般比TM低5度,有利于引物的结合。第三个温度叫做延伸,一般采用72度。是引物结合后DNA聚合酶按照模板合成新的链。一分钟一千个碱基对。如此循环。现在很多PCR都采用2部法,由于采用了不同的DNA...
荧光定量
PCR的
引物
与普通PCR引物能否通用?
答:
主要看你的产物大小,如果你的PCR产物在80-250bp之间,且用的是SYBR法或有合适的探针,那还是通用的
如何设计sybrgreen法
荧光定量
pcr
引物
答:
引物
探针按照述原则设计循环参数确定经起始变性
温度
(根据Tag酶要求设定)反应要经95℃15-20秒60℃60秒于些模板45秒足够数据
退火
检测 e)优化探针引物浓度 于双探针反应通选择探针引物浓度优化反应结能获低CT值及相于背景说
荧光
值高增 引物浓度应该50nM -900nM 范围内进行优化面表格显示前引物9种能浓度...
实时
荧光定量
PCR——RT-QPCR
答:
(5)点击增加按钮,输入amplification,定义扩增循环的次数为445次,选择
荧光
的收集功能Quantification (6)设定PCR扩增循环的温度与时间为95℃10s (7)点击增加按钮,设定
退火温度
为60℃10s 【6.7两步 Analysis Mode默认None】(8)设置延伸温度和时间为72℃20s Acquisition Mode选择Single (9)设置溶解...
实时
荧光定量
PCR中两种
引物
的设计有什么要求
答:
9、以公式Tm=4*(G+C)+2*(A+T)-5计算Tm值,也就是
退火温度
。选择较低Tm值的
引物
的退火温度为反应的退火温度,最好保证每个引物的Tm值相匹配,且在70-75℃范围内;10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小,PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度,如果期待的产物长度等于或...
荧光定量
PCR
引物
设计的问题
答:
你可以在软件设计出来的基础上,手动的把你的
引物
移动几个碱基,可以减少一些二聚体或错配,而且,软件给出来的这些结果都只是计算值,你实际应用的时候,
退火温度
都要五六十度了,即使有部分二聚体在这个温度下也打开了,如果害怕出问题,你可以针对同一转录组多设计几对引物,然后选一组最好的用 ...
定量的PCR
退火温度
和
荧光定量
PCR是一样的吗
答:
一般来说
荧光定量
的
退火温度
更高一些。荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料(sybr green)或者和目的DNA片段结合的荧光探针(taqman),通过监控PCR过程中的荧光的变化,并且和某些管家...
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