转化前载体与DNA于16℃连接12h,感受态冰上化冻后立即加入连接产物,冰上放置20-30min,热激60s,后立即转到冰上静置2min,加1ml LB液体培养基于37℃恒温水浴摇床培养复菌1h(不含amp),离心弃850-900菌液,后涂版
1 LB固体培养基不加amp,10h后没有菌落
2 LB固体培养基加amp,连接产物的不生长(600bp),加载体中对照标准片段(700bp)不生长,(注,以上两种都进行16℃连接转化)直接加载体于感受态的的不生长(直接加入后转化)
说明热激过程有问题,但42℃我经过温度计测量没有问题,感受态也换了几批,实在是想不出问题来了
哎,此实验耽搁我大半学期时间,至今未果,我这个心情呀
这句说错了“1 LB固体培养基不加amp,10h后没有菌落”
实际是: 1 LB固体培养基不加amp,10h后形成致密菌落
应该是转化的问题吧
因为不加amp能生长,加了的,无论是什么实验,都不生长。
我一直考虑载体问题,可换了三次载体了,全是买的,最近定的pmd-18T
载体,我没法怀疑是它的问题了
amp也没有失效呀,因为不加AMP的都长了
我是说你载体的AMP表达有问题 所以不加AMP的都长了 先按照我说的实验步骤试试咯
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