跑PCR，还能看到明显的亮带，但是我分别做回收，回收一个500和一个2800的PCR片段，却怎么也回收不出来。

Question

跑PCR，还能看到明显的亮带，但是我分别做回收，回收一个500和一个2800的PCR片段，却怎么也回收不出来。回收试剂盒，我也试过几种的了，到底是怎么回事，有哪些我没有注意的地方。另外，最后一步洗脱，我用DD水洗难道不行吗，一定比洗脱液的效果差很多吗，我都是用的DD水洗的。。

Answer 1

最好是用试剂盒附带的洗脱液洗脱，然后用同一公司的连接、转化试剂盒，一般不会有影响，同公司的产品在设计的时候会考虑这些因素进去的。
还有就是你可以试试P两次，把两次的胶放在一起回收，然后洗脱液少加点。

Answer 2

水确实比碱性的TE效果要差一些。
另外，你用洗脱后的溶液作为底物做一次PCR，就知道有没有产物回收了。
一般回收后都会有损失，跑胶不一定能直接看到追问

看来兄台也是这么想，用TE冲洗可能效果好些。。。
但是我也有疑问，
1 如果用TE，是否会影响下步的T4连接酶连载体的反应啊，毕竟是用DD水冲洗的话，影响要小一些。。
2 按照各位老师的观点，似乎跑胶看不出来，也不能说明回收不成功。。。但是这样即使回收成功了，是否量会很少，从而不利于下一步的目的片段连到载体呢。这样各位老师有什么建议没有。谢谢大家了。。

追答

尽量用小体积ph8，TRIS（不含EDTA）洗脱，这样在下一步链接的时候影响不大。
还有一个办法，就是在做胶的时候多做一排孔，跑胶的时候缓冲液不要加太满，刚好没过胶面就可以了。这样你要的条带跑到第二排孔的时候，直接吸出来就可以了。

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Answer 3

你有没有试过凝胶回收试剂盒？P个4.5管25ul体系的。50ul的话减半，任何全加一大孔胶里面跑。然后切胶用试剂盒回收，那样纯化回收的效果很好。而且没有引物二聚体影响克隆

Answer 4

你是怎么判断没有回收下来的追问

回收以后，我拿着回收的样做电泳，基本看不到条带啊，这样能用吗，我有点怀疑。。。这样会不会即使回收有，量也太少了，下面就无法做PCR目的片段连接载体啊。。。
我真的是新手，以前从没做过实验，我多么希望能得到一定经验指导啊。。

追答

回答总是被审核。。 回收会有损失 不要电泳 直接连接