高压灭菌，是指将物品置于密闭的高压灭菌容器中，利用高压饱和蒸汽使微生物中的蛋白质、核酸发生变性，从而杀灭微生物的方法。该方法灭菌能力强，是最有效、套用最广的一种灭菌方法。加大蒸汽压力能提高蒸汽温度，增进杀菌效果。一般培养基在121°C（103.4kPa蒸汽压）灭菌维持30min即可一次达到完全灭菌，耐热的芽胞在30min内全部杀死。牛奶、明胶等培养基最好采用115°C灭菌15〜20min；含葡萄糖等单糖的培养基宜111〜113°C灭菌15〜20min，以免温度过高引起变质或分解。
使用高压蒸汽灭菌时，须先加适量水于灭菌器中，待灭菌物品放好后，关闭灭菌器，打开气门，将灭菌器内空气除尽后方可关闭气门，升温加压，调节热源或安全阀保持压力（温度）不变。灭菌结束后，停止加热，压力回零后，打开气门，最后开盖取出物品。