人类前额叶背外侧皮质转录组尺度的空间基因表达
Kristen R. Maynard
一些基础内容，放在前面：
空间转录组学: 将基因的表达与组织切片的免疫组化图像进行整合，从而将组织内不同细胞的基因表达信息定位到组织的原始空间位置上去，区分哪些基因在组织内是活跃的，达到直观检测组织中不同部位基因表达的差异。
Visium空间转录组是 把切片在芯片上展开 ,在空间上用条形码来保留切片上每个小点的空间位置信息。
流式细胞仪原理
原位测序原理
10x Visium空间转录组分析思路
发表期刊：bioRxiv
发表时间：2020年2月
发表单位：美国约翰霍普金斯医学院等
该研究使用10x Genomics Visium平台研究了六层的人类背外侧前额叶皮层（DLPFC）中基因表达的空间结构。研究确定了广泛的层富集的表达特征，并细化了与以前层标记的关联。将层表达特征叠加到大规模的单核RNA测序数据上，增强了表达驱动簇的空间标注。通过整合神经精神障碍基因集，显示了精神分裂症和自闭症谱系障碍相关基因的差异层富集表达，突出了空间定义表达的临床相关性。之后，开发了一个数据驱动的框架来定义空间转录组学数据中的非监督簇（unsupervised clusters一种机器学习），该簇可以应用于形态学结构不如皮质层状结构定义明确的其他组织或脑区域。最后为科学界创建了一个Web应用程序，以探索这些原始数据和总结数据，以加快目前的神经科学和空间转录组学研究(
http://research.libd.org/spatialLIBD)。
（1背景、2目前的方法及缺陷、3全基因组空间转录组学的优势）
背景：
目前的方法以及缺陷：
全基因组空间转录组学的优势：
3个死亡的，神经正常的成年人脑，每个都在DLPFC位置取4个切片（两组，两组之间相距300微米，组内的两片紧挨着）每一片厚度10微米
取完样本之后，用visium方法建库测序，利用测序数据，将数据分层（大脑灰质的皮层分为6层，下面附带一些白质层，一共7层）
测序完成之后，先做spot的分层，（分层方法：用传统的标志基因，判断spot属于哪个层，同时做t性降维，根据计算结果加入人为注释，把spot分配到各个层中
12个切片一共分配了76个层（8*7+4*5）
对76个层做主成分分析PCA(principal component analysis)，（PCA的特点：在千变万化的数据中找到主要矛盾）可以得到分层的信息
对每个层中高表达的基因进行验证和分析，（这些是以往已知的标记基因）
由本次的visium数据，发现新的在特定层高表达的标记基因
评估之前的研究中确定的层高表达表基因是否合适(P-value.Rank percentile), visium技术可以把广域的空间和广谱的基因表达都进行分析，找出的基因就更具有代表性
Hafner基因集在分布上的特殊性（Hafner基因集：Hafner等人做的突触相关的基因集。
无监督unsupervised(PCA方法的前50个主成分做的聚类)、半监督semi-supervised(富集出来的差异表达基因作为指导，对spot做的聚类)、有监督markers(把以往做的标记基因作为监督条件来进行聚类)聚类分析
(A) DLPFC在垂直于软脑膜表面的解剖平面获得组织块，并延伸至灰质交界处。每个块横跨6个皮层和白质。
(B)实验设计简图，包括从三个独立的神经正常的成年供体中获得的两对“空间复制”。每对由两个直接相邻的10个微米系列组织切片组成，第二对位于第一对后300微米处，共12个样本在视觉平台上运行。
(C)标本151673 DLPFC组织块及相应组织学。
(D-F)显示样本151673中SNAP25 (D)、MOBP (E)和PCP4 (F)基因对数转化归一化表达(logcounts)的spot图。这些基因的表达通过描绘灰质/神经元(SNAP25)和白质/少突胶质细胞(MOBP)的边界并定义L5 (PCP4)，确认了每个样本的空间方向。12个样品的SNAP25, MOBP, PCP4的spot图见图S1，图S2，图S3。
(A)“pseudo-bulked”统计程序的可视化描述，该程序将每个组织切片中的空间转录组数据从点级(约4000个点)折叠为层级(6层+白质)数据。
(B)对所有切片(‘pseudo-bulked’)表达谱的主成分分析(PCA)。第一主成分分离白质和灰质，第二主成分与层相关联。以MOBP为例，对用于评估各层富集的三种统计模型的可视化描述，包括
(C)“方差分析”模型,测试七层方法是否不同
(D)“浓缩”模型,测试每一层是否不同于所有其他层- WM(橙色)和其他6所示层(浅蓝色)
(E)“成对”模型,哪些测试彼此每一层相对的另一层- WM所示(橙色)和L3(浅蓝色),其他层的灰色。
(A-D)
左:基因FABP7 (A, L1>rest, p =5.01e-19)、PVALB (B, L4>rest, p =1.74e-09)、CCK (C, L6>WM, p =4.48e19)、ENC1 (D, L2>WM, p =4.61e-25)的对数转化归一化表达(logcounts)箱式图。
中间:样本151673中基因FABP7 (A)、PVALB (B)、CCK (C)和ENC1 (D)的对数转化归一化表达（logcounts）的spot图。
右图:原位杂交(ISH)图像来自Allen人脑图谱的成年人大脑颞叶皮质(A, D)、DLPFC (B)或视觉皮质(C):
http://human.brain-map.org/(Hawrylycz et al.， 2012)。箱和点图可以使用我们的web应用程序进行重现:
http://spatial.libd.org/spatialLIBD。艾伦脑图谱图像的标尺=1.6毫米
(A-D)
左:基因AQP4 (A, L1>rest, p =1.47e-10)、TRABD2A (B,L5>rest, p =4.33e-12)、HPCAL1 (C, L2>rest, p =9.73e-11)、KRT17 (D,L6>rest, p =5.05e-12)的对数转化标准化表达(logcounts)箱式图。
右:样本151673中AQP4 (A)、TRABD2A (B)、HPCAL1 (C)、KRT17 (D)的对数转化归一化表达(logcounts)spot图。
(E)DLPFC皮层条带的多路单分子荧光原位杂交(smFISH)。描述DAPI(核)、AQP4、HPCAL1、TRABD2A、KRT17和脂褐素自身荧光表达的最大强度共聚焦投影。merge图像，无脂褐素自发荧光。【可能是因为脂褐素会自发荧光，所以要merge图像】
（A）空间配准方法概述。 皮尔森相关值的热图评估了我们导出的700个基因的层富集统计数据（y轴）与Hodge等人产生的人类颞叶皮层中snRNA-seq数据的
（B）层富集统计数据之间的关系。 （Hodge等人，2019）（这些数据仅描绘了灰质，x轴上的1-6层）和
（C）细胞类型的统计数据，这些数据由Mathys等人注释 。 来自人类前额叶皮层中的snRNA-seq数据（Mathys等人，2019）（x轴）。 Oli =少突胶质细胞，Ast =星形胶质细胞，Mic =小胶质细胞，Opc =少突胶质前体细胞，Per =周细胞，End =内皮，Ex =兴奋性神经元，In =抑制性神经元。
使用Fisher的精确检验对我们的层富集统计数据与一系列相关的预定义基因集进行了富集分析。
（A）SFARI（Abrahams等人，2013）和Satterstrom等人（Satterstrom等人，2020）的自闭症谱系障碍（ASD）层流富集了102个ASD基因（ASC102）。 根据Gandal等人在PsychENCODE（PE）中的报道，进一步将其分为53个主要为ASD（ASD53）和49个主要为发育迟缓（DDID49）的基因，以及ASD与神经性对照患者大脑中差异表达（DE）的基因 研究（Gandal等人，2018）。
（B）精神分裂症（SCZD）基因，包括来自差异表达（DE）和转录组范围关联研究（TWAS）的基因，这些基因来自大脑的RNA序列数据 与BrainSeq（BS）（Collado-Torres等人，2019）和PE（Gandal等人，2018）研究中的神经型对照相比，患有SCZD的个体与神经型对照相比。 “上”和“下”标签分别表示与神经型对照相比，患有ASD或SCZD的个体中基因的表达水平更高还是更低。 色标表示-log10（p值），其阈值设置为p= 10 -12。重要热图单元内的数字表示富集的比值比（OR）
（A）基于细胞结构和选定的基因标记对DLPFC层进行监督注释（如图2 A所示），被用作``ground truth'' 以评估样本151673的数据驱动的聚类结果。
（B）图解说明数据驱动的聚类流水线的示意图，包括：
（i）以无偏见的方式识别基因（HVG或SVG），
（ii）对这些基因进行聚类分析（clustering/cluster analysis）
（iii）通过与ground truth比较来评估聚类性能。
（C）比较使用Spatial DE（对数似然比，LLR）和DE'富集'模型的基因（图S7）鉴定的SVG的基因方式测试统计数据（图S7）（F统计;包括WM） 对于样品151673。颜色表示选定的基因具有层状（红色阴影）和非层状（黄色阴影）表达模式。
（D）使用样本151673中的Spatial DE（与（C）中突出显示的基因相对应）识别的选定层状（上排）和非层状（下排）基因的表达模式。
（E）可视化聚类结果
（i）``无监督''聚类（方法为``HVG_PCA_spatial''，它使用来自scran的高度可变基因（HVG）（Lun等人，2016）），50个主要成分（PC）来降低维度 ，并包含空间坐标作为聚类的特征）；
（ii）“半监督”聚类，这些聚类是通过使用DE富集模型确定的层富集基因进行指导的；
（iii）在Zeng等人的已知标记的指导下进行聚类。 （Zeng et al。，2012）（方法详细信息：数据驱动的富层聚类分析和表S10）。
（F）使用手动注释的ground truth layers（如（A）中所示）和adjusted Rand index（ARI），对所有12个样本中所有方法的聚类性能进行评估。 点代表每种方法和样品，结果按聚类方法进行分层（方法详细信息：数据驱动的富层聚类分析和表S10）。 使用适用于每种方法的线性模型（所有方法的总体模型：p = 5.8e-6），P值表示将两个空间坐标作为特征包含在聚类中时ARI得分差异的统计显着性。