pcr需要的原料有:物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液。
PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
扩展资料:
PCR反应特点:
一、特异性强
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
二、纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
三、简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
参考资料来源:百度百科—PCR
参加PCR反应的物质主要有五种即:引物、酶、dNTP、模板和缓冲液。
1、引物有多种设计方法,由PCR在实验中的目的决定,但基本原则相同。PCR所用的酶主要有两种来源:Taq和Pfu,分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。
2、酶一般是DNA水解酶和DNA聚合酶,DNA水解酶用于切断磷酸二酯键的酶,这些酶使糖磷酸酯主链上的磷酸二酯键水解。
3、模板即扩增用的DNA,可以是任何来源,但有两个原则,第一纯度必须较高,第二浓度不能太高以免抑制
4、在PCR反应中,使用低dNTP浓度,可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100μl的反应体系中,4种dNTP的浓度为20μmol/L,可基本满足合成2.6μg DNA或10pmol/L的400bp序列。
5、缓冲液的成分最为复杂,除水外一般包括四个有效成分:缓冲体系,一般使用HEPES或MOPS缓冲体系;一价阳离子,一般采用钾离子,但在特殊情况下也可使用铵根离子;二价阳离子,即镁离子,根据反应体系确定,除特殊情况外不需调整。
参考资料来源:百度百科-聚合酶链式反应
参考资料来源:百度百科-dNTP
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