1937年淞沪会战拉开战幕后，由于上海附近的铁路处于日军火力范围内，故从杭州开往上海北部和从南京进军上海南郊的军队就只能经过苏嘉铁路。故铁路成为了前线与后方，上海西部外围联络的最重要交通线，苏州、嘉兴两站亦成为重要军事中转站。因此，敌机以苏嘉铁路为重点袭击目标之一。著名文学家茅盾在《苏嘉路上》一文中写道：“苏嘉路，贯通了沪杭、京沪两线的苏嘉路在负荷“非常时期”的使命。……但伴着列车一路的，却有一条银灰色的带子这便是运河。而这善良的运河不幸成了敌机寻觅苏嘉路最好的标帜”。
8月17日，嘉兴站首次被日军飞机轰炸。9月19日上午，两架日机在嘉站附近投弹7枚，部分路基、铁轨被毁。下午，日机轰炸苏州站，投弹18枚，炸毁车站房屋，死伤四五百人。10月13日，5架日机又在嘉站上空投弹11枚，炸毁月台、天桥及路轨，苏嘉铁路嘉兴段亦遭轰炸。15日上午，两架日机在平望站投弹3枚，桥轨多处被毁，整座车站被炸成废墟。19日、22日相门站两次被炸。11月13日，3架日机在苏嘉、沪杭甬两路交叉处投弹两枚。
在淞沪会战的三个多月中，苏嘉铁路为保卫上海注入了不计其数新鲜血液：7月下旬， 61师补充2旅 经本线进驻上海虹桥机场。8月29日，中央军校教导总队一部经本线至嘉兴赴奉贤增援。9月底，19师110团沿本线乘车至苏州转上海。11月5日，预备11师由本线开赴枫泾阻击日军。8日，109师327旅经本线开往嘉善阻击日军……苏嘉铁路频频被炸，但在铁路职工的努力下，对破坏了设施都在上半夜修好，保证了下半夜军车的安全行驶。苏嘉铁路更是难民的生命线，天天都有运送难民的列车，车厢、车顶都坐满了人。
由于国民政府军顽强抵抗，日军在上海进展缓慢。日军第10军6、18、114师团等部遂在11月5日在杭州湾金山卫登陆，一路直趋上海，另一路进攻枫泾，企图截断苏嘉、沪杭甬两铁路，阻止国民党军后撤。7日，日本参谋本部发出命令，明确限制日军不得越过苏嘉铁路制令线的进行任何行动，以等待国民政府对于和谈的答复。8日，国民党军第三战区指挥部下令全线撤退。9日，第10军主力向平望－嘉兴一线推进，18师团和114师团指向嘉兴。11日，上海沦陷。13日，第三战区发布《第三战区司令长官作命第十号》，规定以左翼作战集团西撤至吴福线，以右翼作战集团撤至乍平嘉线，左右两大集团由苏嘉铁路相互联结，把日军阻止于常熟－苏嘉铁路之线以东。14日，南路日军侵占平望，苏嘉铁路被迫停止运行。北路日军发起进攻，3、9师团沿京沪铁路直指苏州。15日，国民政府军右翼军总司令张发奎到桐乡濮院督战，第10集团军总部进驻嘉兴机场。中午时分，嘉善方向之敌纠集铁路王江泾方向之敌，分东北两路包抄嘉兴，国民党军在苏嘉、沪杭甬两路奋力堵截。当天，日军侵占王江泾。16日，日军第10军将平望作为兵站，准备沿太湖南岸进攻南京。18日晨8时，国民政府军开始撤离嘉兴。中午，由王江泾沿苏嘉铁路南下之日军和沪杭甬铁路、嘉平公路三面之日军，进攻嘉兴。日军一部进犯苏嘉铁路97号桥，国民党军一部在秋泾桥与铁路上的日军展开激战（桥上至今仍留有弹痕）。下午3时，日军一部攻入嘉兴城内，驻守秋泾桥的国民党军某部因伤亡过重至深夜退出嘉兴。同日，吴江被沿苏嘉铁路北上的日军侵占。同时，国民党军千余人在苏州孙家浜阻击沿京沪铁路西侵的日军。晚10时，孙家浜失守，驻守苏州城的国民党军约四万人散乱地向无锡撤退。19日，日军在狂热的前线军官的允诺下发起突破苏嘉铁路制令线的战斗，向南京进攻。晨6时，日军18师团片冈、藤山等部；114师团矢崎、山本、山田等部由沪杭甬铁路、苏嘉铁路和嘉平公路攻入嘉兴，嘉兴沦陷。同日16时，苏州被日军6师团、9师团占领。至此，苏嘉铁路全部沦于日军之手，国民政府苦心经营的苏浙国防工程中最长的防线——乍平嘉-吴福线全线崩溃。
沦陷后，日军在苏嘉沿线大肆烧杀掳掠，横尸遍野，满目苍凉。又迫使数千民工加紧修复铁路，欲使铁路成为其侵略工具，实现其所谓的“以战养战”的方针。1939年4月26日全线修复完毕。30日，日伪 “华中铁道株式会社” 成立，苏嘉铁路为“华铁”霸占。苏嘉铁路各站站长、司机、职员甚至检票员几乎都是日本人，苏嘉、沪杭两铁路各站日籍人员共有300多人，中国员工只能担任杂役。苏嘉铁路全线恢复通车后，每日开行混合车3对，但主要开行军用列车。1940年后汪伪政府铁道部名义管辖铁路，但仍为“华铁”和日本军方直接控制。
日军采取各种措施封锁保护苏嘉铁路，沿线各站均建有碉堡，另外在嘉兴栖真乡丹牌荡村建有一座两层炮楼，苏州段亦建有多座碉堡。1938年，苏嘉铁路、沪杭甬铁路和嘉平公路上驻有日军200多人。3月间，强抽壮丁拼凑铁路护路队，夜间在苏嘉、沪杭甬铁路上巡逻放哨。虽然苏嘉铁路成为了日军的重要军事线路，但江浙两省的游击队一直活跃在铁路沿线，演绎了一出江南的“铁道游击队”：1938年1月，“日军调江南主力部队至徐州战场，在浙北仅留少数兵力，国民党第10集团军各部乘机深入杭嘉湖敌后开展游击战”。1938年春，嘉兴“新塍区破坏队”破坏多座苏嘉铁路桥梁。10月28日晚，嘉兴段四座铁桥被炸。1939年上半年，油车港顾烈之自卫队在铁路王江泾附近活动。8月，苏浙皖三省国民党军队发起“八一三”周年纪念全线总反攻，当月朱希部队成功袭击日军新建的弹药库——金家池站（位于平望盛泽之间）。11月7日，国民党军62师某部冒着倾盆大雨进攻王江泾，双方在火车站南的铁路79号桥激战，战势不久蔓延到整个平望、湖州一带。29日晚，嘉兴一游击队在吴江方面配合下，在平望镇南的铁路62号桥附近炸毁了铁路。12月，平望站南的一段路轨被拆。
日军和汪伪自1941年下半年起对沦陷区实行大规模“清乡”，分三期进行。1941年6月，江苏省第一期清乡开始。1942年7月，嘉兴第一期清乡开始，铁路以东地区划归江苏省负责。清乡中，日军进一步封锁苏嘉铁路，在铁路两侧修建竹篱、开挖壕沟。1942年7月，苏嘉铁路旁重要地段设置电网，人一触即毙。日军在各站站前出入口搭建检问所，检查旅客的行李并且搜身。百姓若要穿越铁路，除向日本哨兵鞠躬行礼外，还得交验“良民证”，“稍有不慎就有杀身之祸，而偷越铁路者被日军发现则格杀勿论”。同时，日军组织“爱路会”，在铁路两侧搭设草棚，每晚派人守护铁路。倘若铁路遭破坏而查不出“罪犯”，日军就会在铁路附近村庄里大肆扫荡，惨杀无辜。如1942年8月，某游击队炸毁了盛泽北王乡路段，该乡保长及村民共9人被日军押送到吴江宪兵队进行二十天的酷刑逼供。
在多次清乡中，日军虽先后在铁路沿线投入上万兵力，但在游击队猛烈反攻下，屡遭重创，经常龟缩在铁路据点里和沿线各城镇内。到1943年末，铁路沿线的竹篱已被游击队和群众拆除殆尽。
