从大肠杆菌基因型理解蓝白斑筛选的原理

Question

如题所述

Answer 1

乳糖操纵子：基因表达的精密调控</

在大肠杆菌的代谢网络中，乳糖操纵子（如图1所示）是一个关键的调控结构，由Lac Z、Lac Y、Lac A等结构基因组成，它们分别编码β-半乳糖苷酶、乳糖透性和转乙酰酶。调控区包括启动子Lac P、操纵基因Lac O以及cAMP/CAP结合位点，这些元素共同调节基因的转录活性。

调控的核心是Lac I阻遏蛋白，它在无乳糖时会结合并抑制结构基因的表达。然而，正调控机制通过cAMP-CAP复合物的作用得以解除这种阻遏，当葡萄糖供应充足时，cAMP水平上升，从而促进转录。而乳糖的存在则诱导Lac I构象变化，进一步释放结构基因的表达潜力。此外，葡萄糖效应还影响cAMP水平，影响基因转录的整体动态。

蓝白斑筛选的奥秘</

蓝白斑筛选技术利用的是lacZ基因的缺失突变，如lacZΔM15，这个突变会导致α片段的缺失，使得β-半乳糖苷酶活性受限。当与异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）结合时，只有完整lacZ基因的菌株才能产生蓝色，因为X-gal（5-溴-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-四氮唑紫）只能被β-半乳糖苷酶分解，形成蓝色沉淀。

在实际应用中，如图2和图3所示，载体在lacZα位点插入不同的片段，转染到大肠杆菌的不同菌株中，会出现三种结果：

全蓝色：</当载体的lacZα功能正常或受损（如HB101、DB3.1和STBL3），菌株能正常表达β-半乳糖苷酶，导致X-gal转化为蓝色。
全白色：</原生lac操纵子功能丧失（如PIR1、STBL2和JM108），菌株不能分解X-gal，显示白色斑点。
蓝白斑：</原生lac操纵子破坏并引入lacZΔM15的菌株（如DH5a、DH10B和EPI400），lacZα功能状态会影响是否产生蓝色斑点，这是一种有效的筛选策略。

XL10-Gold菌株的情况类似于前两者，但筛选过程中通常依赖额外的抗性基因（如氯霉素）来区分lacZΔM15的缺失效果。

随着基因编辑技术的进步，科学家可以直接针对HB101、DB3.1、STBL3、BL21等常规菌株的lacZM15进行编辑，以实现更精确的实验设计和筛选。